Что такое хроматография в биологии

Хроматография

Хроматогра́фия (от др.-греч. χρῶμα — цвет) — динамический сорбционный метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Основан на распределении веществ между двумя фазами — неподвижной (твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе) и подвижной (газовая или жидкая фаза, элюент). Название метода связано с первыми экспериментами по хроматографии, в ходе которых разработчик метода Михаил Цвет разделял ярко окрашенные растительные пигменты.

Содержание

История метода

Метод хроматографии был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция, для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Впервые термин хроматография появился в двух печатных работах Цвета в 1906 году, опубликованных в немецком журнале Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. В 1907 году Цвет демонстрирует свой метод Немецкому Ботаническому обществу.

В 1910—1930 годы метод был незаслуженно забыт и практически не развивался.

В 1931 году Р. Кун, А. Винтерштейн и Е. Ледерер при помощи хроматографии выделили из сырого каротина α и β фракции в кристаллическом виде, чем продемонстрировали препаративную ценность метода.

В 1941 году А. Дж. П. Мартин и Р. Л. М. Синг разработали новую разновидность хроматографии, в основу которой легло различие в коэффициентах распределения разделяемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями. Метод получил название «распределительная хроматография».

В 1947 году Т. Б. Гапон, Е. Н. Гапон и Ф. М. Шемякин разработали метод «ионообменной хроматографии».

В 1952 году Дж. Мартину и Р. Сингу была присуждена Нобелевская премия в области химии за создание метода распределительной хроматографии.

С середины XX века и до наших дней хроматография интенсивно развивалась и стала одним из наиболее широко применяемых аналитических методов.

Терминология

Класcификация видов хроматографии

По агрегатному состоянию фаз

По механизму взаимодействия

По цели проведения

По способу ввода пробы

Смесь непрерывно подают в колонку, при этом на выходе из колонки только первый, наименее удерживаемый компонент можно выделить в чистом виде. Остальные зоны содержат 2 и более компонентов. Родственный метод — твердофазная экстракция (сорбционное концентрирование).

В колонку после подачи разделяемой смеси вводят специальное вещество-вытеснитель, которое удерживается сильнее любого из компонентов смеси. Образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых веществ.

Источник

Сущность метода. Его применение в биологии и медицине

Хроматография является эффективным методом разделения, анализа и физико-химического исследования веществ. В его основе лежат различия в адсорбционных или иных свойствах соединений, благодаря чему они по-разному распределяются между адсорбентом и проходящей через его слой жидкостью или газом.

Основоположником хроматографического метода и самого термина «хроматография» является русский ботаник М.С. Цвет. В 1903 году он опубликовал работу о разделении хлорофилла на компоненты, пропуская его раствор через трубку, заполненную адсорбентом СаСО₃ (рис. 2.20). При этом был получен ряд окрашенных полос-зон, соответствующих отдельным пигментам, что послужило основанием для названия метода хроматографией (цветоописанием). Тогда же М.С. Цвет указал на возможность разделения и бесцветных соединений.

Сущность хроматографического метода заключается в том, что через слой адсорбента, являющегося неподвижной фазой, пропускают поток элюента – жидкости или газа-носителя (подвижная фаза), содержащего в своем составе разделяемую смесь. Встречая на своем пути свободную поверхность адсорбента, со свободными адсорбционными центрами, компоненты разделяемой смеси адсорбируются и, если их адсорбционная способность различна, смесь разделяется на зоны, каждая из которых преимущественно содержит чистое вещество. Раньше других на адсорбенте всегда связывается компонент, наиболее прочно адсорбирующийся. Последним адсорбируется вещество, имеющее слабое сродство к адсорбенту. Неадсорбирующиеся компоненты выйдут из слоя адсорбента вместе с элюентом.

При дальнейшем пропускании чистого элюента сорбировавшиеся зоны начнут двигаться по слою адсорбента, вследствие непрерывно идущего процесса адсорбции-десорбции, и подхваченные током жидкости или газа будут выходить с элюентом в определенной последовательности: первыми – наиболее слабо сорбирующиеся, последними – сильно сорбирующиеся. На выходе с адсорбента компоненты фиксируют либо с помощью автоматических детекторов (в газовой и жидкостной хроматографии), либо путем отбора фракций раствора и анализом их методами спектрофотометрии, рефрактометрии и т.д.

После завершения хроматографического разделения результаты представляют в виде графика, откладывая по оси ординат концентрацию компонента в зоне, а по оси абсцисс – объем пропущенного через адсорбент растворителя (элюента) или время. Таким образом, для построения графической хроматограммы необходимо определить концентрацию каждого компонента в его зоне, последовательность расположения зон и расстояние между их центрами. Типичная хроматограмма разделения смеси двух различных веществ представлена на рис. 2.21. Она может быть записана самописцем хроматографа или быть построена по экспериментальным данным.

Количественный состав смеси определяется из допущения, что интенсивность пика каждого компонента пропорциональна его содержанию в смеси. В качестве меры интенсивности принимается площадь пиков. Существуют разные способы измерения площадей пиков. Наиболее простым из них является умножение высоты пика h (рис. 2.21) на его ширину w, измеренную на полувысоте пика: S=h·ω.

Хроматографию можно считать универсальным методом, так как она позволяет разделять смеси практически любых веществ. При этом возможна работа как с макроколичествами, так и с микроколичествами соединений. В зависимости от характера задач различают аналитическую хроматографию (качественную или количественную), когда разделяют малые количества веществ, и препаративную, позволяющую получать концентрации, достаточные для исследовательских работ. В настоящее время возможно применение хроматографии и в промышленном масштабе. Достоинство хроматографии и в том, что она легко поддается автоматизации.

Хроматография имеет большое значение в биологии и медицине. Это объясняется тем, что при исследовании компонентов клетки, производстве лекарственных препаратов во многих случаях требуется предварительное выделение компонентов в чистом виде. Проведение анализов в медицинской практике также включает хроматографическое разделение исходных смесей. Врач, получая данные о результатах качественного определения анализируемых веществ в крови или другой биологической жидкости, имеет реальную возможность правильно оценить результаты лечения, эффективность применяемых методов, установить необходимую длительность проведения операции, перитонеального диализа и хирургических методов детоксикации (гемодиализа, гемосорбции).

Хроматография в газовой фазе позволяет количественно оценить весь клинически значимый спектр стероидов. Разработаны методы определения катехоламинов – адреналина, норадреналина и родственных им соединений, гормонов щитовидной железы, альдостерона и кортизола. Хроматография нашла применение при гигиеническом анализе полимерных материалов; состава выхлопных газов; анализе воздуха в производственных помещениях и операционных палатах; хлор-, азот- и фосфорсодержащих пестицидов; определении загрязнений в промышленных сливах (содержание фреонов, различных кислот и их производных, ароматических соединений – фенола, спиртов, нитрилов и т.д.); для оценки качества пищевых продуктов; для концентрирования и установления природы органических примесей в стоках фармацевтических предприятий.

Технический прогресс сделал возможным создание так называемых метаболических профилей биосред – крови, мочи, слюны, выдыхаемого воздуха. В одном таком образце методами газовой хроматографии анализируется несколько сотен компонентов. Метаболические профили так же индивидуальны, как и отпечатки пальцев, но, в отличие от папиллярных узоров хроматограмма метаболитов человеческого организма несет в себе массу медицинской информации – какие лекарства или продукты получал человек в последнее время, какими микроорганизмами вызвано его заболевание и многое другое.

Быстро прогрессируют и другие инструментальные хроматографические методы, среди которых перспективна жидкостная хроматография, где элюентом служит жидкая фаза. Этот метод позволяет анализировать нелетучие биологические образцы – белки, витамины, нуклеотиды, различные лекарственные средства.

Источник

Хроматография: история открытия, основные понятия, область применения

Хроматография — способ разделения смесей, который изобрел русский ученый Михаил Семенович Цвет в 1900 году. Заключается в различии свойств компонентов смесей, разнице их реакций при нахождении в одинаковых условиях.

История хроматографии

Первое в истории упоминание о хроматографии (chromatography — «пишу цветом») было в 1901 году, когда российский ученый-биолог М. С. Цвет выступил с докладом на 11 съезде естествоиспытателей и врачей в г. Санкт-Петербурге. В этот период он исследовал растительные пигменты, изучал процесс фотосинтеза и пытался разделить хлорофилл на составляющие его пигменты. Ученый пропустил раствор пигментов через стеклянную емкость с адсорбентом, и пролил чистым раствором. Состав окрасился в разные цвета, разделившись на полоски. Это называется молекулярная хроматография. Статью о результатах своей работы ученый опубликовал в 1903 г.

С 1910 по 1930 гг. этот метод почти не исследовался.

Следующее упоминание в истории принадлежит европейским ученым Р. Куну, А. Виртенштейну, Э. Ледеру. В 1931 году, используя этот метод, они выделили из сырого каротина составляющие a- и b-каротин.

Важным этапом развития стало открытие в 1941 году английскими естествоиспытателями А. Мартином и Р. Сингом жидкостного варианта, где подвижное вещество — бумага, смоченная водой с бутанолом.

В 1975 году ученые из США ввели в терминологию новый вариант хроматографии — ионную.

Суть метода хроматографии

Метод хроматографии основан на постоянно повторяющихся с конкретной периодичностью процессах сорбции-десорбции, которые происходят между подвижным веществом с растворенной в нем пробой (элюентом) и неподвижным (сорбентом). Компоненты исследуемой смеси имеют различную степень сорбции (впитывания), за счет чего поглощаются сорбентом с различной скоростью и степенью. Суть метода заключается в многократном повторении этих процессов. Получившиеся пробы после изучения в хроматограмме позволяют уточнить состав реактива.

Теоретические основы хроматографии

В теории этот метод представляет собой последовательный процесс уравновешивания составляющих смеси, когда происходит деление на 2 части — подвижную и недвижную.

В колонке, или «тарелке», недвижная часть (фаза) уравновешивается с подвижной. Это константа распределения К (первая ступень). Далее подвижная часть устремляется в другую «тарелку» и приходит в равновесие (вторая ступень). И эти ступени повторяются многократно в хроматографии. Сущность метода выражается в «теории тарелок». Но это упрощенно, так как движение постоянное, что не дает 100% чистоту данных в измерении константы.

Понятия и определения метода зафиксированы ГОСТ 17567-81.

Выделяют адсорбцию, когда поглощение происходит на поверхности границ и абсорбцию, когда вещества расходятся между 2-х фаз.

Виды хроматографии

Виды хроматографии классифицируют по особенностям процесса разделения (по данным Википедии):

Классификация эта весьма условна. Все виды тесно связаны между собой. Так, в аналитической по цели использует проявительную по способу введения элюента. Кроме того, в каждом показателе могут выделяться дополнительные критерии. В технике проведения дополнительное влияние дают технические условия (высокое или низкое давление).

Капиллярная хроматография

Лекции по капиллярной начинаются с ответа на вопрос о том, для чего она нужна. Быстрое развитие метода привело к вопросу разделения смесей, состоящих из веществ, близких по физическим и химическим свойствам. Новую капиллярную колонку для решения этих задач изобрел М. Голей в 1957 году. Ее диаметр изменяется в пределах 0.05-0.15 мм, стандартный диаметр — 0.11 mm, а длина — 40-200 мкм. Самая длинная колонка достигала 477 м.

Данный вид позволяет решать различные экологические задачи — исследование воздуха на наличие летучих органических соединений (кратко — ЛОС), определение содержания пестицидов в почве. Разработаны методики:

Первоначально этот метод использовался для исследования качества нефтепродуктов, определения процентного содержания нефти в бензине.

Препаративная хроматография

Препаративная ставит цель выделять чистое вещество из смеси, причем в значительных количествах. Особенность — выполнение непрерывного разделения смеси. Для получения большего количества вещества увеличивают объем колонки в хроматографической установке.

Аналитическая хроматография

Используя аналитическую, проводят качественный и количественный анализ соединений — оксидов, кислот, окисей, полимеров.

В книге-учебнике Бражникова В. В., Сакодынского К. И. «Аналитическая хроматография» дано описание механизма работы хроматографа при качественном и количественном анализе.

В конце колонки расположен аппарат, измеряющий концентрацию вещества в элюенте — детектор. Время, прошедшее с момента поступления вещества в колонку до наступления максимальной концентрации вещества, называется время удерживания в хроматографии. Эта величина постоянна для каждого вещества, если в колонке поддерживается постоянная внешняя и внутренняя температура, и на основе этих данных делают качественный анализ.

Количественный анализ осуществляется через измерение площади и расположения пиков на хроматограмме.

Хроматография практическая

Современный метод хроматографии предназначен для решения практических задач. Сегодня использование этого метода актуально в биологии, криминалистике, химии, медицине, быту. Самые простые примеры доступны для проведения даже дошкольнику. Для опыта с чернилами разного цвета и простой водой в качестве растворителя не требуется современного оборудования, сложных расчетов и технологичной лаборатории. Школьники и студенты вузов проводят опыт по размыванию чернил на уроках химии.

Флюидная хроматография

К высокоэффективным видам относится флюидная. Процесс в данном случае проходит в сверхкритических условиях, где в качестве подвижной фазы берут газ, больше похожий на гель. Достоинство этого вида — определение верного состава любых микросоединений, которые не дают сигнал спектроскопам или другим детекторам.

С помощью флюидной хроматографии успешно анализируется состав лекарственных средств, продуктов, полимеров, сырой нефти, ПАВов.

Хроматография аминокислот

Данный метод играет большое значение при идентификации аминокислот и белков. Проводится техникой на листе бумаги по распределительному принципу. Определение вида аминокислоты проходит в несколько этапов:

Основные достоинства этого метода: точность получаемых данных и легкость расчетов.

Разновидности хроматографии по механизму разделения веществ

В качестве адсорбента (вещества-поглотителя) часто используют алюминий и его производные: окиси фракции 0.063-0.2 мм (ТУ 6-09-3916-75, 6-68-164-2011, 6-68-164-99 и оксиды (ТУ 2163-004-81279372-11). В качестве растворителя обычно используют гексан (hexane) hp-ultra очистки (ТУ 6-09-3375-78 и 2631-001-54260861-2013), криохром. Купить особо чистые (ОСЧ) химические реактивы можно в фирме «Вектон».

Процессы ионообменной хроматографии применяются для изучения биологических жидкостей (кровь, моча, плазма) и диагностики заболеваний.

На характере взаимодействия между сорбентом и сорбатом основывается классификация по механизму разделения веществ.

Разновидности хроматографии по агрегатному состоянию фаз

По агрегатному состоянию фазы хроматографические методики бывают четырех видов.

Газовая: жидкостно-газовая и газо-твердофазная. Подвижной фазой выступает инертный газ (гелий, азот, водород, диоксид углерода) или воздух, который должен быть чистым, инертным по отношению к сорбенту и исследуемому веществу, хорошо растворять смесь. Неподвижной фазой служит либо жидкость, либо вещество.

Одним из направлений газовой является парофазный анализ, отличие которого заключается в том, что изучается не жидкий или твердый объект, а газовая фаза (пар).

Жидкостная — жидкостно-жидкостная и жидкостно-гелевая. Жидкостная фаза, служащая сорбентом, должна отвечать соответствующим требованиям (хорошо растворять компоненты смеси, иметь термическую устойчивость, небольшую вязкость и способность образовывать пленку с носителем). Теоретические основы ВЭЖХ раскрыты в книге — пособии С. Н. Сычева «Высокоэффективная жидкостная хроматография», сокращенно ВЭЖХ.

Флюидная. Подвижная находится в сверхкритических условиях — высокое давление, критическая температура.

Полифазная. Неподвижная фаза — смесь твердых и жидких компонентов.

Данные методы используются для исследования смесей органических соединений.

Качественный анализ в хроматографии

Качественный анализ пробы проводится на хроматографе, который измеряет и записывает характеристики, составляет схему. Полученную по результатам исследования хроматограмму изучают, высчитывают, используя формулы, закон Генри, уравнение Ван-Деемтера, сравнивают с эталонными градуировками и делают расшифровку.

Исходные графические данные, на основе которых проводят качественный анализ, называют элюционными характеристиками (параметрами). К ним относятся:

Методики постоянно улучшаются и дорабатываются — составляются специальные таблицы по результатам испытаний, что позволяет получать более точные данные для качественного проведения исследований.

Где применяется хроматография

Первоначально этот метод был применен в биологии первооткрывателем М. С. Цветом. В настоящее время он используется практически во всех сферах — промышленности, медицине, экологии, криминалистике, фармацевтике.

Хроматография в биологии

Хроматография в биологии в настоящее время применяется на постоянной основе. Основным методом хроматографии в биологии является газовый. Это проведение тестов на уровень содержания пестицидов в почве, вредных веществ в воде и воздухе. Метод ЖХ/МС/МС, объединяющий жидкостное хроматографирование и тандемную масс-спектрометрию, вместе с центрифугированием используется при расщеплении липидов, белков, углеводов до простых компонентов для дальнейшего их исследования, которым занимается наука протеомика.

Хроматография в химии

Хроматография — это в химии один из основных методов исследования, позволяющий получить точные и проверенные данные. Представители IUPAC (Международного союза теоретической и прикладной химии) участвовали в разработке стандартов обозначения хроматографических процессов.

Различные виды метода применяются для исследования свойств анаэробных и аэробных веществ, извлечения из смеси веществ необходимого препарата. Каждое предприятие химической промышленности использует хроматографические методы на этапе контроля качества сырья и других технологических процессов.

Хроматография в медицине

В клинической медицине эти методы применяются в тесной взаимосвязи с биологией. Изучение беременности, хромосом, медицинское лечение различных микробных инфекций, патологий, отравлений происходит без использования антибиотиков и сывороток, основываясь на принципах жидкостно-адсорбционной хроматографии, где неподвижная фаза — адсорбент, жидкая — кровь, плазма, лимфа, а разделяемая смесь — внутренние жидкости с метаболитами токсинов.

Хроматография в криминалистике

Криминалистические хроматографические методы предполагают решение государственных задач через проведение исследований в следующих областях:

В криминалистике широкое применение получили две разновидности жидкостного метода: хроматографирование в тонких слоях сорбента и 2-й — хроматография на бумаге.

Хроматография в цитологии

В цитологии метод применяется при изучении клеточного строения в витальной форме («при жизни»).

Хроматография нефти

На НПЗ хроматографический метод применяется для определения физических свойств нефти (теплопроводности, плотности), уровня содержания серосодержащих примесей. Так как от этого напрямую зависит качество продуктов — бензина, моторного топлива, трансформаторного масла.

Хроматография в фармации

В фармацевтической отрасли хроматографические методы применяются в нескольких науках: фармакопея (лат. pharmacopoeia), фармация и фармакогнозия. В фармакопейном анализе широкое применение получил ионообменный вид и метод спектрометрии, с помощью которых удается выделить из смеси микроскопически малые части за небольшой промежуток. В косметологии в состав средств для ухода за волосами входит метилпропансульфокислота, получаемая препаративным методом.

Где используется хроматография в быту

В домашних условиях возможно бесплатно провести самые простые эксперименты, демонстрирующие сущность разных видов хроматографии.

Опыт с бумагой (можно взять обыкновенную промокашку) и спиртовым экстрактом календулы прекрасно демонстрирует принцип действия бумажной.

Если капнуть на бумагу сначала эфирный раствор календулы, а затем этиленгликоль, в итоге через небольшой промежуток времени на бумаге образуется несколько разноцветных колец. Прослеживается прямопорциональная зависимость количества веществ в смеси и количества колец.

Селективность в хроматографии

Селективность — это свойство одного объекта подбирать свойства другого объекта, работающего в тандемной связке, под свои потребности для решения задачи.

В хроматографии используют термин селективность колонки, и чем она выше, тем лучших результатов можно достичь. Возможность выбирать сорбент, состав растворителя, химическую структуру и свойства компонентов смеси, температуру колонки — это факторы, изменение которых выводит селективность на высокий уровень.

Индекс удерживания в хроматографии

Индекс удерживания вещества — это величина, измеряющая время нахождения молекулы изучаемого вещества в подвижной фазе.

Неподвижная фаза в хроматографии

Неподвижная фаза — это вещество, которое выступает в роли сорбента для анализируемых веществ. Неподвижной фазой выступает твердое вещество с пористой поверхностью, в некоторых случаях жидкости.

Электрофорез и хроматография

Электрофорез, используя ток, и хроматография решают одни и те же задачи — разделение смеси веществ, выделение их составляющих. Но при этом есть существенное отличие. Процесс электрофореза — электрохимический, он состоит из неподвижной и мокрой подвижной фазы, а 2-ой использует стационарную и подвижную фазы.

Применяют в медицине в биохимии жидкостей (крови, плазмы).

Что общего между экстракцией и хроматографией

Экстракция — это разделение смеси жидких или твердых веществ. Активируют селективные растворители (экстрагенты). Общее с хроматографическими методами — деление исследуемого вещества на части и его выделение из общей массы.

ТСХ хроматография и ГСО

ТСХ (расшифровка — тонкослойная хроматография) протекает при перемещении подвижной фазы на тонком слое (до 0,20 см) неподвижного сорбента, нанесенного на твердую поверхность — пластинку (стекло, металл, малеинизированный полимер, акриламидо).

Испытание лекарственных средств на абсолютную подлинность и посторонние примеси — основная задача этой методики.

В исследованиях, для обеспечения чистоты полученных результатов, в качестве сорбента и растворителя используют вещества высшего класса по государственным стандартным образцам (ГСО).

Виды детекторов в хроматографии

Пробы исследуются в хроматографе, который фиксирует и анализирует все изменения пиков, используя градуировочные детекторы. Основные из них:

Это насадочные приборы, применяемые в хроматографии. Каждый год, и в 2017, и 2020 годах, изобретаются новые модификации и формы детекторов.

Достоинства хроматографии

К преимуществам относят:

Это отличает хроматографические методы от других.

Недостатки хроматографии

Есть отдельные недостатки у каждого вида.

Диапазон применения хроматографических методов очень широк: от исследования составляющей клетки до объектов Солнечной системы. Эти методы незаменимы в нефтехимической, пищевой, газовой, экологической промышленностях на этапе контроля и поддержания оптимального графика производства.

Источник