что такое субоптимальная визуализация
Что означает на узи визуализация затруднена
Основная информация об УЗИ
Акушеры-гинекологи начали прибегать к средствам ультразвуковой диагностики в работе с беременными женщинами ещё в конце 60-х годов прошлого века. За прошедшее время методы эхографии значительно модернизировались, а благодаря многолетней практике и значительно обогатились запасами полезной информации, помогающей специалистам правильно устанавливать диагнозы. Беременным полагается пройти три ультразвуковых исследования, проводить которые необходимо под конец каждого триместра.
Благодаря полученным данным, врачи вовремя могут обнаружить какие-либо проблемы с процессом развития плода, а, следовательно, вовремя среагировать, спасти жизнь и здоровье будущего человечка. Кстати, нельзя не упомянуть о боязни проходить сонографию у некоторых мамочек. Ученые давно были озабочены воздействием ультразвуковых волн на живой организм, потому было проведено немало масштабных клинических исследований, результатом которых стали следующие данные: высокочастотные звуковые волны не несут никакого вреда человеческому организму, в том силе и тому, который находится в материнской утробе.
Пройти УЗИ во время беременности – это один из шагов, который даст уверенность в том, что малыш родится здоровым.
Затруднения с визуализацией
Вполне может случиться так, что при прохождении планового обследования, в результатах может оказаться подобное словосочетание: визуализация затруднена. Что означает на УЗИ визуализация затруднена – этот вопрос возникнет у любой женщины, которая увидит данную фразу во врачебном заключении.
На самом деле, стоит сразу же отбросить какие-либо опасения и страхи. Во время второго скрининга проводится обследование плаценты, её осматривают на предмет наличия кисты и отложений кальция, который может усложнить её функционирование. Изучают на этом исследовании также количество околоплодных вод, и в том случае, когда плод занимает особое положение, не дающее возможности определить его пол – применяют данную формулировку. Огорчаться не стоит, ведь при прохождении третьего скрининга специалист уже совершенно точно сможет указать пол вашего будущего малыша.
Прохождение ультрасонографии – совершенно необходимая процедура.
Заключение
Пройти скрининговое обследование можно во множестве учреждений, но мы советуем доверить здоровье и жизнь будущего малыша специалистам, которые имеют за спиной многолетний опыт, и смогут прийти вам на помощь в любой, даже самой сложной ситуации.
Следите за своим здоровьем, ведь оно залог счастливой жизни ваших будущих детей.
Осмотр сердца плода в ходе рутинного ультразвукового исследования во II триместре беременности: анализ наиболее распространенных ошибок
УЗИ сканер HS70
Точная и уверенная диагностика. Многофункциональная ультразвуковая система для проведения исследований с экспертной диагностической точностью.
Введение
За последние 20 лет прогресс новых медицинских технологий привел к появлению и бурному развитию такой области медицины, как ультразвуковая пренатальная диагностика. Разработаны и постоянно совершенствуются алгоритмы осмотра различных органов и систем плода, определены оптимальные сроки беременности для проведения скрининговых ультразвуковых осмотров. Достигнуты значительные успехи в диагностике некоторых врожденных заболеваний (например, болезни Дауна), а эффективность пренатального выявления отдельных пороков развития (например, анэнцефалии, кистозной гигромы шеи) достигает 100%. Тем не менее эффективность выявления такой важной группы заболеваний, как врожденные пороки сердца, все еще оставляет желать лучшего.
Пороки сердца являются наиболее распространенным врожденным заболеванием плода и занимают более 50% в структуре детской смертности, связанной с врожденной и наследственной патологией [1]. Несмотря на высокую разрешающую способность современной ультразвуковой аппаратуры, наличие цветового допплеровского картирования во всех современных аппаратах, частота выявления пороков сердца плода не превышает 40-45% [2]. В определенной степени такие скромные показатели связаны с небольшими размерами и сложной анатомией исследуемого объекта, а также с наличием динамических изменений, характерных для определенных пороков сердца плода, в связи с чем клиническая картина становится очевидной уже после 24 нед беременности. Однако в гораздо большем проценте случаев «пропуск» пороков сердца связан с нарушением методологии рутинного осмотра этого органа. Данная статья посвящена описанию наиболее распространенных ошибок, возникающих при рутинном осмотре сердца плода, и представляет методы оптимизации ультразвукового изображения при оценке основных сечений сердца.
Сечения, применяемые для рутинного осмотра сердца плода
Оптимизация изображения сердца плода
При оценке любого из перечисленных сечений необходимо установить оптимальные настройки ультразвукового аппарата, чтобы добиться наилучшей визуализации исследуемого объекта. К сожалению, в большинстве клинических руководств по пренатальной ультразвуковой диагностике теме физических принципов получения ультразвукового изображения отводится крайне незначительное внимание. Это и приводит к недостаточной осведомленности врачей о физике ультразвукового исследования и неумению и даже боязни самостоятельно настроить ультразвуковой аппарат.
а) Эхограмма получена при сканировании в общем акушерском режиме. Обращает на себя внимание более широкий угол развертки изображения, контуры структур сердца более утолщенные и нечеткие по сравнению с изображением сердца в специальном сердечном режиме с узким углом развертки изображения.
б) Эхограмма получена при сканировании в сердечном режиме. Контуры структур сердца более четкие, изображение более контрастное, по сравнению с изображением сердца на рис. 1a.
Второй наиболее распространенной ошибкой, которая имеет место при проведении ультразвукового исследования, является несоответствие расположения исследуемого органа и зоны фокусировки ультразвукового изображения. Данная ошибка характерна и для осмотра других органов и систем плода, но особенно значимо она сказывается при проведении осмотра сердца. Примеры изображения сердца одного и того же плода при различной глубине зоны фокусировки представлены на рис. 2.
а) Зона фокусировки установлена выше исследуемого объекта.
б) Зона фокусировки установлена на уровне исследуемого объекта.
в) Зона фокусировки установлена ниже исследуемого объекта.
Описанные выше ошибки в настройке аппарата являются легко устранимыми и не требуют от оператора серьезных технических навыков, при этом четкость полученного изображения существенно возрастает. Возникновение следующей ошибки связано с выбором оптимального положения сердца плода для проведения осмотра. Достаточно часто врачи проводят осмотр сердца при субоптимальном его расположении, при этом часть исследуемого объекта не визуализируется в связи с наличием акустической тени от позвоночника, ребер или конечностей плода. Если осмотр сердца производится при наличии акустических теней от позвоночника, ребер или конечностей, то адекватная оценка предсердно-желудочкового соединения, межжелудочковой перегородки и кровотока в камерах сердца и магистральных сосудах значительно затруднена, что может приводить к «пропуску» порока сердца. Рекомендовано осуществлять осмотр сердца плода в таком его положении, чтобы верхушка сердца была направлена к датчику (на 11 и 13 ч). При исследовании сердца в положении верхушкой вниз осмотр области межжелудочковой перегородки, особенно ее мышечной части, затруднен, что увеличивает вероятность «пропуска» ее дефекта. Однако не обязательно дожидаться, чтобы плод сам принял положение «лицом к пупку матери»; смещение датчика по животу пациентки без изменения плоскости сканирования приведет к получению искомого изображения. При этом движения не должны носить хаотический характер, а осуществляться строго в ту сторону, куда направлена верхушка сердца плода (т.е. если верхушка сердца плода направлена к правому боку пациентки, то датчик смещается туда же и наоборот). Примеры изображения сердца одного и того же плода при смещении датчика показаны на рис. 3, 4.
Акустическая тень от позвоночника перекрывает часть сердца.
Смещение датчика к левому боку матери приводит к получению оптимального изображения 4-камерного среза сердца плода. Для оптимизации изображения сердца при положении плода «спинкой кверху» потребовалось чуть более 1 мин.
После получения изображения сердца плода верхушкой к датчику необходимо увеличить изображение таким образом, чтобы поперечное сечение грудной клетки плода занимало большую часть экрана. Строгое следование этому требованию связано с тем, что размеры сердца плода во II триместре составляют около 2 см и исследование такого маленького объекта требует максимального увеличения. Недопустимо проводить осмотр сердца без увеличения, так как при этом невозможно четко оценить межжелудочковую перегородку и область предсердно-желудочкового соединения. Многие современные ультразвуковые аппараты имеют возможность увеличения изображения уже после нажатия кнопки «freeze» (функция «post-freeze zoom»). Использование этой функции при проведении осмотра сердца недопустимо, так как в основе получения такого изображения лежит использование эффекта цифрового увеличения, т.е. изображение создается путем анализа информации от соседних пикселей (точек) и генерации новых пикселей, несущих усредненную информацию. Таким образом, полученное изображение сердца, несмотря на достаточные размеры, не будет нести никакой дополнительной диагностической информации; более того, контуры сердца будут более размытыми и нечеткими по сравнению с тем же изображением сердца без его увеличения.
В связи с этим единственным правильным способом увеличения изображения сердца является использование функции аппаратного увеличения («high definition zoom»). Выбор зоны для увеличения производится в режиме реального времени, все дальнейшее исследование происходит в реальном времени. На экране монитора ультразвукового аппарата появляется увеличенное изображение исследуемого органа, а в нижней части экрана возникает дополнительное изображение всей области сканирования с выделением той ее части, которая подверглась увеличению (рис. 5, а). Примеры изображения сердца одного и того же плода без увеличения и при использовании функции цифрового и аппаратного увеличения представлены на рис. 2, б и 5 а, б.
а) Увеличение изображения при помощи функции «high definition zoom».
б) Увеличение изображения при помощи функции «post-freeze zoom».
Согласно существующим отечественным рекомендациям, рутинное скрининговое исследование сердца плода во II триместре беременности выполняется с использованием только В-режима. Однако следует отметить, что использование режима цветового допплеровского картирования существенно увеличивает информативность исследования сердца плода, во многих странах Западной Европы и США в настоящее время рекомендуется использовать цветовой допплер при каждом осмотре сердца плода. Нежелание отечественных специалистов использовать цветовое допплеровское картирование во многом связано с неумением менять настройки этого режима; в полученном изображении цветовые сигналы «заливают» изображение камер сердца и перегородок, проводить анализ такого изображения невозможно. Для преодоления этих ошибок необходимо помнить несколько простых правил, которые приведены ниже.
Значения скоростной шкалы установлены на 38 см/с, что позволяет получить изображение ламинарного тока крови в желудочках.
Кровоток в полых и легочных венах, напротив, характеризуется низкой скоростью, поэтому их оценка должна проводиться при низких значениях скоростной шкалы (10-20 см/с). Если проводить осмотр полых или легочных вен при том же значении скоростной шкалы, что использовалось для оценки камер сердца и магистральных артерий, то цветовой сигнал от них может отсутствовать.
Исходя из этого же принципа, необходимо менять значения цветового фильтра, который позволяет исключить сигналы от движения стенок и другие низкоскоростные сигналы. При оценке отделов сердца, в которых кровоток имеет высокую скорость, необходимо устанавливать высокие значения цветового фильтра, тогда как при исследовании полых и легочных вен необходимо пользоваться низкими значениями фильтра.
Во-вторых, при осмотре сердца в режиме ЦДК необходимо правильно выбрать размер цветового окна, так как при больших его размерах частота смены кадров существенно снижается, что приводит к получению менее четкого изображения. В связи с этим необходимо ограничивать размеры цветового окна границами сердца и крупных сосудов. Недопустимо, чтобы размер цветового окна занимал всю область сканирования, так как полученное при этом изображение будет очень размытым. Частота смены кадров не будет достаточной для регистрации всех изменений на протяжении одного сердечного цикла, и при исследовании в режиме реального времени это будет приводить к возникновению изображения с высокой степенью кадрированности, т.е. не плавного перехода систолы в диастолу, а прерывистой регистрации отдельных фаз сердечного цикла.
В-третьих, при оценке сердца в режиме ЦДК достаточно часто возникает необходимость изменить усиление (gain) цветового сигнала, как правило, в сторону его уменьшения. Осмотр сердца плода при высоких значениях усиления цветового сигнала является самой распространенной ошибкой, приводящей к появлению артефактов в виде наложения цветового сигнала на границы исследуемых структур, например, на межжелудочковую перегородку, приводя исследователя к ложному впечатлению о наличии ее дефекта (рис. 7). Необходимо начинать осмотр сердца при низких значениях усиления цветового сигнала, постепенно увеличивая их до достижения оптимальной картины.
Заключение
Описанные в настоящей статье правила настройки аппарата, без сомнения, не являются гарантом успеха при диагностике пороков сердца плода. Для успешного осмотра сердца необходимо глубокое знание нормальной и патологической анатомии сердца плода и тех динамических изменений, которые имеют местопри беременности. Тем не менее строгое следование всем правилам настройки аппарата при каждом осмотре сердца плода существенно улучшает условия визуализации и способствует выявлению даже небольших отклонений от нормальной ультразвуковой картины этого органа.
Литература
УЗИ сканер HS70
Точная и уверенная диагностика. Многофункциональная ультразвуковая система для проведения исследований с экспертной диагностической точностью.
Жизнь и судьба: визуализируем клеточный состав ткани
Аденокарцинома легких при многоцветном окрашивании. Изображение получено с помощью имиджинговой системы MACSima компании Miltenyi Biotec.
Автор
Редакторы
Методы, которыми пользуются клеточная биология и гистология для визуализации белков в тканях, постоянно совершенствуются, и на сегодняшний день позволяют увидеть локализацию более ста маркеров одновременно. Это помогает решать интересные задачи, в первую очередь, в онкологии, «наблюдая» за опухолевыми клетками в естественной среде обитания. Эта статья — краткий обзор новейших методик визуализации клеток и перспектив, которые они открывают.
Ультрасовременные методы
Методы, которыми оперирует современная наука, постоянно совершенствуются. Некоторые области развиваются настолько стремительно, что порой даже специалистам сложно уследить за новейшими приборами и модификациями методик. Так происходит, например, в геномике. Другие же области (такие как гистология и связанные с ней световая и флуоресцентная микроскопия) развиваются куда медленнее, но всё равно расширяются и обзаводятся более высокопроизводительными методами. В статьях нового спецпроекта (он продолжает наш хит — «12 биологических методов в картинках») мы хотим рассказать, какие методы помогают ученым совершать новые открытия сегодня, и чего нам ждать в будущем.
Партнер публикации — компания ООО «Биокоммерц»: поставщик современного оборудования, реагентов, расходных материалов и сервисной поддержки в сфере клеточных технологий, проточной цитометрии и продукции клинического применения.
Команда квалифицированных и опытных специалистов при работе с клиентами придерживается индивидуального подхода и предоставляет современные решения для реализации смелых научных проектов. Среди клиентов ООО «Биокоммерц» — крупнейшие институты и научные центры страны, ведущие фармацевтические и биотехнологические компании.
Все знают, что тело человека состоит из тканей, а ткани — из клеток. Именно их характеристики, в основном, и определяют ее функциональность. Однако любая ткань — это не просто набор разных клеток, а сложно структурированная система, в которой, порой, важную роль играет не только то, кто именно ее составляет, но и как и с кем взаимодействует. Особенно хорошо это видно, если посмотреть на опухоль.
Опухоль — это тоже ткань, которая вырастает в не предназначенном ей месте, тесня соседей. Ее клетки в результате мутаций приобретают способность неограниченно делиться, и также расползаться по организму, прорастая в соседнюю ткань и путешествуя в отдаленные органы, где они дают начало метастазам. Казалось бы, всё самое главное для роста и развития опухолей заложено непосредственно в самих клетках, но это не так. Для успешного роста опухолевым клеткам необходимо взаимодействовать и с внеклеточным матриксом, и с клетками нормальной ткани, и с иммунными клетками, причем нередко успешность роста напрямую зависит от этих контактов. Опухолевое микроокружение [1] — совокупность клеток и молекул, ими производимых, — важнейшая составляющая успеха роста новообразования. Например, то, какие именно иммунные клетки соседствуют с опухолью, зачастую определяет ее агрессивность и стратегию лечения. «Опухолевые разговоры» могут происходить и более опосредованно, например, через экзосомы — маленькие пузырьки с разнообразным содержимым, которое диктует клетке, что ей делать [2].
В клинической практике срезы ткани так и называют — «стёкла». — Ред.
В широком смысле маркером называется молекула, количество которой необходимо оценить. В случае ИГХ маркер — это антиген для визуализирующих антител. — Ред.
Рисунок 1. Пример традиционного ИГХ-анализа опухолевой ткани щитовидной железы, в котором детектировали CD3 — маркер Т-лимфоцитов. В качестве красителя использовали DAB (диаминобензидин), поэтому Т-лимфоциты, находящиеся среди опухолевых клеток, окрашены в коричневый цвет. Рядом с ними неокрашенные — опухолевые — клетки, которые можно распознать по различным цитологическим особенностям и производству маркеров, которые также можно визуализировать при помощи ИГХ.
экспериментальные данные автора статьи
Такая задача, кстати, нередко стоит перед исследователем. Скажем, необходимо посмотреть колокализацию двух маркеров, рецептора и лиганда, двух типов клеток (например, Т-лимфоцитов и клеток опухоли) или распознать определенный подтип клеток, который никак нельзя выделить по наличию только одного антигена. Так происходит, в том числе, с клетками иммунной системы.
Иммунные клетки — чрезвычайно важные игроки опухолевого микроокружения, поэтому их характеристика важна для понимания прогноза пациента и перспектив его лечения. Особенно в эпоху блокаторов иммунологических чекпоинтов [4], успешно применяющихся в онкологии. Если иммунных клеток в опухоли много и они готовы быть реактивированы для уничтожения опухолевых клеток, то такие препараты могут отлично сработать. Опухоли, которые вызывают сильный иммунный ответ, называются иммуногенными [5]. К ним относятся, например, меланома, рак легких и рак почки.
Сколько маркеров нужно, чтобы распознать иммунные клетки?
Иммунные клетки чрезвычайно разнообразны [6], поэтому сказать: «Я вижу лимфоцит» — всё равно, что не сказать ничего. Множество субпопуляций внутри каждого вида клеток иммунитета выполняют нередко диаметрально противоположные действия в организме, поэтому важно понять, кто именно находится перед тобой. Фенотипирование иммунных клеток — сложная и многоступенчатая задача, и чтобы ее решить, нужен не один маркер-антиген, а много. Например, фенотипирование подтипов Т-лимфоцитов по вырабатываемым ими цитокинам требует регистрации около 30 антигенов, а Т-клеток памяти — почти 50 [7]. А это в 50 раз больше, чем может позволить стандартная ИГХ!
Самое простое решение — взять несколько срезов, сделанных последовательно, и каждый из них покрасить своим антителом. Так, как правило, и делается в рутинной клинической практике. Понять взаимное расположение маркеров на таких пошаговых срезах легко, но, конечно, с допущением: надо помнить, что срез имеет толщину в несколько микрометров, и каждый последующий, соответственно, проходит по другим, хоть и соседним, клеткам. На рисунке 2 — окрашивание пошаговых срезов лимфоидного фолликула на основные маркеры иммунных клеток. По ним можно увидеть характерное строение и взаимное расположение клеток.
Рисунок 2. Визуализация основных типов иммунных клеток в раке щитовидной железы. H&E — окрашивание гематоксилином-эозином; CD3 — Т-лимфоциты; CD79a — все B-клетки; CD20 — зрелые В-клетки.
экспериментальные данные автора статьи
Второе возможное решение — одновременное окрашивание антителами с двумя разными хромогенами — соединениями, обусловливающими цвет получившегося окрашивания. Тогда на одном и том же срезе можно посмотреть выработку двух маркеров и корректно сравнить их между собой. Но, конечно, для полноценного анализа двумя маркерами не обойдешься.
И тут на помощь приходит флуоресцентная микроскопия! Почему бы не окрашивать срез сразу целым набором из нескольких антител с различными флуоресцентными метками? Тогда картины окрашивания каждого из них можно наложить друг на друга и увидеть «портреты» отдельных клеток по нескольким маркерам (рис. 3)! Кроме того, громадным преимуществом использования флуорофоров является чувствительность: для того, чтобы увидеть свечение, достаточно всего 50 сигналов на кубический микрометр!
Флуорофор [3], [8], или флуоресцентная метка, прикрепленная к визуализирующему антителу, способна при возбуждении лазером определенной длины волны излучать свет определенного спектра. О микроскопии подробно рассказано в одноименной статье цикла «12 методов в картинках» [9]. — Ред.
Рисунок 3. Окрашивание четырех ассоциированных с Т-лимфоцитами маркеров в ткани карциномы из клеток Меркеля при помощи флуоресцентно меченных антител. CD8 — рецептор на поверхности Т-киллеров; CXCR3 — хемокин, экспонируемый в первую очередь на активированных Т-лимфоцитах; гранзим Б — важнейший белок, участвующий в процессе контактного цитолиза. По этому изображению можно судить, что в опухолевой ткани есть Т-лимфоциты, способные уничтожить опухоль методом контактного цитолиза.
К сожалению, даже флуоресцентная микроскопия бессильна перед сложными случаями, когда количество маркеров очень велико. Дело в том, что со временем флуоресцентный сигнал затухает, и бесконечно переключать лазеры для того, чтобы «подсвечивать» разные метки, не получится. Кроме того, спектры флуорофоров, в идеале, не должны перекрывать друг друга, чтобы картина, получившаяся при использовании одного, не интерферировала с другим. Это также ограничивает число меток. Поэтому, как правило, при стандартном флуоресцентном окрашивании детектируют лишь 3–4 маркера за эксперимент.
Итак, одновременно визуализировать на срезе ткани множество маркеров не под силу ни традиционной ИГХ с использованием красителей, ни ИГХ с визуализацией при помощи антител с флуорофорами. Что же делать? Использовать современные высокотехнологичные решения! В их основе тоже лежит детекция флуоресцентного сигнала, однако система его генерации здесь устроена намного более хитроумно.
Вариант 1: тирамид-сигнальная амплификация
Тирамид-сигнальная амплификация (TSA) — метод, благодаря которому можно окрасить срез на восемь маркеров одновременно. Процедура предельно проста: это классическая ИГХ с чуть видоизмененными конечными этапами. В качестве вторичных — визуализирующих — антител используются антитела, меченные пероксидазой хрена, после чего добавляется конъюгат тирамида с флуорохромом. Тирамид — органическое вещество, которое в присутствии пероксидазы в силу ее ферментативной активности присоединяется к органическим молекулам вокруг (в данном случае к первичному, вторичному антителу и даже самому маркеру: рис. 4, рис. 7). Циклы окрашивания-детекции повторяются последовательно для каждого из маркеров. В результате системы на основе TSA в 10–100 раз чувствительнее стандартной флуоресцентной микроскопии и позволяют использовать первичные антитела одного видового происхождения, поскольку в этом случае нет перекрестных реакций. На этом принципе основано решение Akoya Phenoptics: комбинация наборов реагентов Opal, платформ Mantra и Vectra 3, а также программного обеспечения для корректного анализа получившихся изображений позволяет решать такие задачи, как оценка эффективности противоопухолевых лекарств по уменьшению количества опухолевых клеток или выделение субпопуляций опухолевых клеток по экспонированию того или иного маркера (рис. 5).
Рисунок 4. Принцип тирамид-сигнальной амплификации. Антиген последовательно инкубируется с первичными и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, после чего добавляется тирамид с флуоресцентной меткой. Этот комплекс ковалентно связывается с белковыми молекулами (антигеном и обоими антителами).
Рисунок 5. Картина мультиспектрального окрашивания иммунных клеток в опухолевой ткани щитовидной железы при помощи TSA. CD4 — маркер Т-хелперов; CD8 — маркер Т-киллеров; PD-1 — иммунологическая контрольная точка; PD-L1 — иммунологическая контрольная точка (лиганд для PD-1); Foxp3 — маркер регуляторных Т-клеток; CK — цитокератин. Таким образом удалось идентифицировать, какие именно Т-клетки экспонируют молекулы — иммунологические чекпоинты.
Вариант 2: баркоды с флуорохромами
Тирамид-сигнальная амплификация требует цикличного повторения окрашивания и детекции сигнала, поскольку для каждого антитела требуется новая порция реагента с тирамидом. Если же первичные антитела к каждому из маркеров сделать уникально детектируемыми, то окрашивание можно производить сразу на несколько маркеров одновременно. Так работает система Akoya Codex: срез ткани инкубируется с первичными антителами, каждое из которых несет на себе уникальный штрих-код — небольшую олигонуклеотидную последовательность (рис. 6, рис. 7). Далее эти антитела визуализируются не вторичными антителами, как это обычно бывает, а реагентом из комплементарного олигонуклеотида, меченого флуорофором. За один раз добавляют три таких реагента, спектры флуоресценции которых не пересекаются. Сигнал детектируется, реактивы удаляют — и цикл повторяется. Производители говорят, что таким образом можно окрасить ткань до 50 раз без потери качества.
Рисунок 6. Схема эксперимента при использовании системы Akoya Code. Шаг 1: Окрашивание антителами с пришитыми к ним олигонуклеотидами. Шаг 2: Визуализация сигнала при помощи флуорофоров, конъюгированных с олигонуклеотидами. Шаг 3: Отмывка флуорофоров. Шаг 4: Повторение окрашивания.
брошюра Akoya Code
Рисунок 7. Эволюция иммуногистохимической визуализации: от хромогенного окрашивания к использованию флуорофоров, тирамин-сигнальной амплификации и баркодов. а — Стандартная ИГХ с хромогенным окрашиванием. б — ИГХ с флуоресцентным окрашиванием. в — ИГХ с использованием принципа TSA. г — ИГХ с использованием конъюгатов флуорофоров с олигонуклеотидами.
рисунок Аполлинарии Боголюбовой по [13]
Вариант 3: комплекс генноинженерных антител с легко удаляемым флуорохромом
Новейший метод мультиплексного окрашивания ткани, позволяющий визуализировать сотни (!) белков на одном срезе, основан сразу на двух высокотехнологичных решениях — генетической инженерии антител для окрашивания и флуоресцентной микроскопии высокого разрешения. Принцип прост: срез окрашивается антителами, считывается флуоресцентный сигнал, после чего флуорофор удаляется или обесцвечивается, а цикл повторяется практически неограниченное количество раз. Так работает система MICS (MACSima™ Imaging Cyclic Staining) от Miltenyi Biotec (рис. 8). Казалось бы, всё гениальное просто! Дьявол в деталях: как достичь того, чтобы флуорохром удалялся, не повреждая при этом срез и соседние белки, которые могут быть мишенями для последующих циклов окрашивания?
Рисунок 8. Окрашивание лимфоидной ткани антителами к CD3 (Т-лимфоциты, зеленый), CD19 (В-лимфоциты, красный) и IgD (фиолетовый). Сайт MACSima™ Art позволяет представить, как выглядит одновременное окрашивание различными антителами системы MICS.
Miltenyi Biotec предлагает два пути решения.
Первый — удаление антител химическим реагентом (REAlease Release Reagent). Если мы говорим об обычных антителах, то такой подход неминуемо приведет к повреждению ткани. Однако в данном случае этого не происходит. Дело в том, что антитела, окрашивающие срез, связываются с маркерами так слабо, что их можно удалить щадящим составом [10], не нарушающим поверхность среза. Циклы отмывки можно проводить больше ста раз, получая последовательно новые и новые изображения.
Второй вариант — обесцвечивание флуорохрома (reafinity antibodies). То, что является ограничением традиционной флуоресцентной микроскопии, в этом случае сыграло положительную роль: после проявки сигнала срез помещается в специальный модуль, где на короткое время освещается для обесцвечивания уже прикрепленных флуорохромов. Всё! Ткань готова к новому этапу окрашивания. Оператор сам может выбрать, какой из вариантов удаления флуоресцентного сигнала ему использовать. Как правило, для надежности последовательно применяются оба.
Различные пути модификации получения сигнала приводят к тому, что количество маркеров, которые можно одновременно детектировать на одном срезе ткани, увеличивается. Растет и стоимость эксперимента, ведь он требует не только дорогих реагентов, но и оборудования для детекции сигнала с высокой разрешающей способностью, а также сложно устроенных программ для обработки полученных изображений. Доступность методик широкому кругу пользователей — следующий шаг, который должен быть сделан в ближайшее время.
Один образец — сотни маркеров!
MACSima™ — новейшая, полностью автоматизированная платформа визуализации ткани с ультравысоким качеством. В каждом миллиметре живого существа каждую секунду тысячи белков взаимодействуют друг с другом, обеспечивая функционирование всего организма. Поэтому для расшифровки основополагающих принципов работы биологических систем так важен углубленный анализ клеточного состава тканей.
Рисунок 9а. Преимущества платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Имиджинговая система MACSima™.
Рисунок 9б. Преимущества платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Платформа для имиджинга MACSima™ включает всё необходимое для визуализации в одной системе: прибор, штативы для образцов, специальные антитела и интуитивно понятное программное обеспечение.
Рисунок 9в. Преимущества платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Платформа позволяет получить данные анализа сотен белков и других антигенов в одном образце.
Рисунок 9г. Преимущества платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Обработка данных и визуализация полностью автоматизированы.
Рисунок 9д. Преимущества платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Система дает возможность анализировать любой тип образца, будь то ткань или отдельные клетки.
Рисунок 9е. Преимущества платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Система транспортировки и дозирования жидкости обеспечивает автоматизированное и точное окрашивание.
Рисунок 9ж. Преимущества платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Система оснащена штативами образца и реагентов для точного позиционирования и возможности повторения эксперимента.
Рисунок 9з. Преимущества платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Современный микроскоп обеспечивает сверхчеткую визуализацию.
Доступные в настоящее время техники могут дать лишь очень ограниченный взгляд на сложность биологических систем. Новая технология MICS (мультипараметрический визуализированный клеточный скрин) от компании Miltenyi Biotec впечатляющим образом преодолевает существующие ограничения, поскольку позволяет провести микроскопический анализ беспрецедентного количества белков или других антигенов на одном образце. На основе этой технологии компания разработала платформу визуализации MACSima™ (рис. 9), сделавшую реальностью полностью автоматизированную визуализацию образцов с ультравысоким качеством (рис. 10). Возможность оценки локализации, синтеза и потенциального взаимодействия множества различных белков позволяет ученым исследовать новые горизонты в фундаментальных и биомедицинских исследованиях.
Рисунок 10а. Возможности платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Аденокарцинома легких при многоцветном окрашивании. Маркеры: DAPI — синий, CD68 — красный, каталаза — зеленый, HLA-DR — желтый, CD295 — светло-розовый, CD66 — оранжевый, цитокератин 5/6/8/17/19 — бирюзовый, цитокератин 10/13 — голубой, CD20 — сине-зеленый, calponin — фиолетовый. Изображение получено с помощью имиджинговой системы MACSima компании Miltenyi Biotec.
Рисунок 10б. Возможности платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. Плоскоклеточная карцинома легкого, второй по распространенности вид рака легких. Маркеры: DAPI — синий, CD68 — красный, каталаза — зеленый, HLA-DR — желтый, CD295 — оранжевый, CD66 — розовый, цитокератин 5/6/8/17/19 — бирюзовый, цитокератин 10/13 — светло-голубой, CD20 — сине-зеленый, calponin — горчичный. Изображение получено с помощью имиджинговой системы MACSima компании Miltenyi Biotec.
Рисунок 10в. Возможности платформы визуализации клеточного состава ткани MACSima™ компании Miltenyi Biotec. PDAC (аденокарцинома протоков поджелудочной железы) с маркерами: DAPI — синий, CD3 — красный, CD19 — зеленый, CD55 — желтый, CD4 — оранжевый, CD38 — бирюзовый, CD326 — розовый. Изображение получено с помощью имиджинговой системы MACSima компании Miltenyi Biotec.
Материал предоставлен партнёром — компанией «Биокоммерц»