что такое рекомбинантные аденовирусные векторы
Ученый из МФТИ раскрыл процесс создания вакцины от коронавируса
Как создают вакцину от коронавируса?
Об эксперте: Павел Волчков — кандидат биологических наук, вирусолог, генетик, заведующий Лабораторией геномной инженерии Московского физико-технического института (МФТИ).
Существует много разных подходов к созданию вакцины от COVID-19. Она может быть вирусной, инактивированной, векторной, на основе нуклеиновых кислот. Какая из них окажется самой эффективной — пока никто точно не знает. Если вы разработчик, то можете выбрать любую и принять участие в большой мировой гонке по созданию долгожданной прививки. А можете, как ученые из МФТИ, сознательно отказаться от возможных бенефитов и неспешно заняться разработкой экспериментальной вакцины нового типа.
Одни из самых популярных на сегодняшний день — это рекомбинантные или векторные вакцины. Они изготавливаются на основе вирусов-носителей или вирусных векторов. Как это работает? Вы берете какие-то вирусные частицы, «вычищаете» из них все патогенные составляющие и на их место вставляете нужные вам элементы — генетический материал вируса, против которого изготавливается вакцина. По такому принципу была создана прививка от вирусного гепатита B или ротавирусной инфекции. И по такому же принципу сегодня многие разработчики создают вакцину от COVID-19. В частности, в России векторную вакцину от коронавируса разработали в НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи.
Павел Волчков:
«Чем хорош вирусный вектор? Он способен инфицировать клетки только один раз и не может размножаться в организме человека дальше. Такая особенность делает рекомбинантные вакцины довольно безопасными. При этом в качестве вирусного вектора можно использовать буквально любой вирус из библиотеки человеческих патогенов. Выбор зависит от того, для какого заболевания вы изготавливаете вакцину. Потому что одни вирусы лучше заражают мышцы, другие — легкие, третьи — центральную нервную систему. Например, та же вакцина Центра Гамалеи выполнена на аденовирусном векторе».
Аденовирусы — ДНК-вирусы. Относятся к группе острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) и характеризуются поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, конъюнктив, лимфоидной ткани. Большинство аденовирусных инфекций представляют собой легкую форму инфицирования. Существует семь видов аденовирусов человека (от А до G) и 57 серотипов. Подразделение на серотипы связано с различными способами заражения.
В качестве векторов для вакцин, аденовирусы применяются довольно давно. Эти вирусы хорошо изучены. Согласно данным сайта ClinicalTrials.gov, клинические испытания на людях успешно прошли или проходят более сотни различных вакцин на основе аденовирусных векторов.
Среди главных преимуществ этих вирусов — их естественный механизм взаимодействия с клетками человека. Они способны обеспечивать довольно длительную экспрессию антигена, а это успешно активирует врожденный иммунный ответ.
Антигены — это любые вещества, содержащиеся в микроорганизмах и других клетках (или выделяемые ими), которые несут в себе признаки генетически чужеродной информации, и которые потенциально могут быть распознаны иммунной системой организма.
Павел Волчков:
«При всех плюсах, у аденовирусов есть и ряд минусов. Первое — они обладают провоспалительным эффектом. То есть могут чрезмерно драйвить иммунную систему. Проще говоря — вызывать сильный иммунный ответ. Это один из возможных побочных эффектов вообще всех аденовирусных вакцин. Но есть еще один нюанс. Большинство аденовирусов — это естественные патогены человека. Многие из нас сталкивались в течение жизни с аденовирусными инфекциями. А что это значит? Что в крови у таких людей уже есть нейтрализирующие антитела к этому вирусу. Они могут связываться с компонентами вакцины и блокировать ее действие. Поэтому для некоторых из нас такая вакцина будет совершенно неэффективна».
Вакцина МФТИ: в чем инновация?
Поскольку у аденовирусных векторов есть существенные недостатки, ученые из МФТИ выбрали другие вирусы в качестве вектора — аденоассоциированные вирусы. Что любопытно, раньше никто в мире не использовал их в таком качестве.
Аденоассоциированные вирусы — мелкие ДНК-содержащие вирусы. Размер частиц 22-24 нм. Размножаются только в присутствии аденовирусов. Способны инфицировать клетки человека и некоторых других приматов. Аденоассоциированный вирус, по-видимому, не вызывает заболеваний у человека, поэтому провоцирует слабый иммунный ответ.
Один из плюсов аденоассоциированных вирусов — они давно и успешно используются в генной терапии. Сегодня зарегистрировано несколько лекарственных средств на их основе. Одно из самых нашумевших — Luxturna. Это первое генное лекарство, созданное для лечения наследственной слепоты, вызванной мутацией гена RPE65.
По аденоассоциированным вирусам также накоплена внушительная клиническая база. На сайте ClinicalTrials.gov можно увидеть, в каком количестве клинических экспериментов аденоассоциированные вирусы уже приняли участие. Это несколько сотен доклинических исследований и порядка 50 клинических экспериментов. Носитель хорошо охарактеризован и, что еще важнее, показана его безопасность. Все это делает аденоассоциированные вирусы весьма привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов не только для генной терапии, но и для вакцин, уверены в Лаборатории геномной инженерии МФТИ.
Еще одной веской причиной создать вакцину на аденоассоциированном векторе стало то, что ученые из МФТИ уже давно придумывают, модифицируют и создают аденоассоциированные вирусы. На сегодняшний день в библиотеке МФТИ их более миллиона. Все они имеют разную специфичность и разные свойства. Что важно, к этим вирусам у человека не может быть иммунного ответа, который бы снизил эффективность вакцины. Поскольку все они созданы искусственно.
Павел Волчков:
«Мы с самого начала понимали, что сможем не только разработать вакцину, но и масштабировать ее производство. То есть произвести столько доз, сколько потребуется или столько, сколько захотим. В мире существует огромное количество аутсорсинговых компаний, которые по GMP сделают вам любое количество доз препарата.
Good Manufacturing Practice (GMP) — правила, которые устанавливают требования к организации производства и контроля качества лекарственных средств для медицинского и ветеринарного применения.
Поэтому с самого начала у нас было четкое понимание, что проблем с производством не будет. Как и проблем с лицензией на вирусный носитель. Это качественно отличает нашу лабораторию от многих других разработчиков вакцин в Российской Федерации. В современном мире все технологии так или иначе кому-то принадлежат, и аденовирусы, и прочие системы векторной доставки, аденоассоциированные в том числе. Живя по правилам свободного рынка, вы не можете просто взять и сделать вакцину на основе любого понравившегося вектора. Вы должны иметь разрешение от компании, которая обладает правами на технологию, либо владеет непосредственно интеллектуальной собственностью в области этого вектора. И тут у нас все хорошо — мы как раз владеем патентом по разработке аденоассоциированных вирусов. Нам не нужно просить ни у кого лицензию на производство данной вакцины, поскольку мы используем собственные же аденоассоциированные вирусы».
Вакцина МФТИ будет эффективна против разных штаммов SARS-CoV-2
Изначально ученые хотели разработать вакцину, которая бы вырабатывала иммунитет практически ко всем поверхностным белкам вируса SARS-CoV-2. А не только к S-белку, как это делают большинство разработчиков вакцин по всему миру (включая НИИ им. Гамалеи). Но в итоге разработчики остановились на конечном числе компонентов. Ими стали S-белок, Е-белок и М-белок.
Павел Волчков:
«По сути мы воплощаем идею совершенно нового типа вакцин — так называемых поливалентных вакцин. Это когда в одном препарате сразу несколько вирусных компонентов. Такой подход кажется нам крайне эффективным применительно к SARS-CoV-2. Ведь на самом деле это не один какой-то конкретный вирус, который распространился по планете. Если мы начнем секвенировать разные изоляты коронавируса, то они все будут отличаться друг от друга. Либо на одну аминокислотную замену, либо на несколько. Поливалентная вакцина как раз направлена на то, чтобы вырабатывать иммунный ответ не к одному поверхностному белку вируса, а сразу к нескольким. В том числе к консервативным поверхностным белкам, которые меньше остальных подвержены мутациям. Так наша вакцина поможет сформировать иммунитет к разным штаммам вируса SARS-CoV-2».
Если текущая разработка покажет свою эффективность и безопасность, ученые планируют пойти еще дальше и разработать вакцину, которая будет содержать не только различные компоненты SARS-CoV-2, но еще и вируса гриппа или других сезонных респираторных вирусов. То есть объединить в одной вакцине генетический материал от самых разных сезонных патогенов. По мнению ученых из МФТИ, такие ассемблированные, поливалентные вакцины могли бы готовить людей каждый сезон к новому остро-респираторному вирусному нашествию.
Что касается текущей разработки (вакцины от COVID-19), то на данный момент ее разработка завершена. Впереди подготовка к доклиническим испытаниям на китайских хомяках и приматах. Если они пройдут успешно, вакцину ожидают испытаниях на людях. Но торопиться и участвовать в текущей «вакцинной» гонке разработчики из МФТИ не собираются.
Павел Волчков:
«Дело в том, что в нашей вакцине слишком много новых компонентов. Несмотря на то, что аденоассоциированные вирусы используются в генной терапии, для создания вакцин их еще никто не применял. Спешка или сокращение сроков проведения доклинических и клинических исследований может обернуться ошибкой и поставить крест на такой многообещающей и перспективной платформе. Но это не значит, что сейчас мы создаем вакцину, что называется «в стол». Во-первых, когда она будет испытана, мы сможем ее продавать другим нуждающимся странам. Во-вторых, наша основная цель — получить опыт по созданию быстрых вакцин, который мы планируем применять в будущем. Как научная лаборатория мы можем проводить такие эксперименты — создавать платформу для вакцин совершенно нового типа. И если у нас все получится, то в следующий раз, когда в мире появится новость о новой вспышке заболевания, мы будем готовы пройти весь путь создания препарата гораздо быстрее, чем мы проходим его сейчас».
Массовая вакцинация от COVID-19 может не понадобиться?
Павел Волчков уверен, что сама по себе гонка по созданию вакцин от короновируса уже не имеет смысла. Он уверен, что к тому моменту, когда российские вакцины будут испытаны и наработаны для массовой вакцинации населения, потребность в них может отпасть. Ученый считает, что уже к осени мы все, так или иначе, переболеем COVID-19 и получим естественный иммунитет.
У этой оптимистичной гипотезы есть основания. Не так давно шведские ученые провели исследование и померяли иммунитет в шведской популяции. Измерялся и гуморальный иммунитет (то есть антитела в крови), и клеточный иммунитет. А именно Т-лимфоциты — так называемые клетки иммунной памяти, которые при повторной встрече с инфекцией «просыпаются» и активизируют иммунный ответ.
Исследование показало, что лишь у небольшой части шведов в крови присутствовали антитела, но примерно треть граждан имела ту самую клеточную память. Это говорит о том, что существенная часть популяции шведов в той или иной форме переболела COVID-19 или имела непродолжительный контакт с вирусом. В последнем случае большой продукции антител не происходит, но благодаря Т-лимфоцитам формируется иммунологическая память к COVID-19.
Павел Волчков:
«Согласно московской статистике, антитела к коронавирусу были определены в крови примерно у 20% жителей столицы. А это около 2 млн человек. Следуя логике шведского исследования, которому у меня лично нет причин не доверять, то скорее всего еще у 20% (а может и у 40% или даже 50-60%) людей уже есть клеточный иммунитет к COVID-19. Эти люди контактировали с небольшими дозами вируса, их иммунная система его детектировала и сформировала клетки памяти. Фактически, половина населения столицы естественным образом получила живую вакцину от COVID-19. Что примечательно, иммунитет, полученный в результате натуральной инфекции, оказывается более стойким, чем от гипотетической вакцины. Потому что в таком случае, иммунная система знакомится с полноценным вирусом (со всеми поверхностными белками), а не с его редуцированной версией, как это происходит при вакцинации. Я думаю, что такая ситуация с клеточным иммунитетом к COVID-19 обстоит не только в Москве, а во многих российских городах. То есть огромное количестве людей по всей России на самом деле уже имеет иммунитет к коронавирусной инфекции».
О чем вы много думали, но боялись узнать #1 — аденовирусная векторная вакцина
Доброго дня уважаемые хабровчане. Я решил освещать некоторые вопросы в сфере медицины в формате мини-текстов по определенным темам. В последнюю неделю самой горячей темой была вакцинация в России, а именно вакцина Спутник V (Gam-COVID-Vac). В этой части я популярно расскажу, что же это за вакцина, как она действует и чего от нее можно ожидать.
Итак, в своем рассказе я последовательно простым языком опишу механизм работы коронавируса, механизм действия аденовируса, как создается аденовирусный вектор для вакцинации, механизм работы аденовирусной вакцины, а также на основе сравнительного анализа всех этих механизмов сделаю выводы.
я сам привит вакциной Moderna по причине того, что у нас просто нет Спутника V для прививания;
свою маму я уговорил привиться Спутником V;
для подготовки к данной статье я пользовался открытыми источниками: статьи, разъяснительные буклеты, базовые знания по молекулярной биологии и генетике, а также базовые знания по вирусологии;
нет, мне не платят рептилоиды, масоны, инопланетяне и Билл Гейтс. Если знаете как с них потребовать выплаты, то сообщите мне в ЛС;
возможно мой рассказ укрепит антивакцинаторские позиции некоторых людей, но я максимально открыто без умалчивания информации составил описание.
Рисунок 1. Механизм действия коронавируса
Рисунок 2. Механизм действия аденовируса
Стоит отметить, что человечество всю свою историю взаимодействует как с коронавирусами, так и с аденовирусами. За время с момента их открытия 1950-1960 годы не было зафиксировано, чтобы аденовирусы встраивали свой геном в геном человека или животного. Поэтому аденовирусы еще с 1970-х годов используют в качестве вирусного вектора для научных целей, когда необходимо, чтобы вирус не встраивался в геном клетки. Для работы с аденовирусами нет никаких дополнительных требований по биологической безопасности и в принципе заказать себе вирусный вектор может каждый (для России я не нашел где можно, но определенно есть профильные институты): VectorBiolabs, Creative Biolabs, TaKaRa, addgene. Также, люди за всю свою жизнь подвергаются множество раз воздействию различными серотипами (версиями) аденовирусов.
Рисунок 3. Геномы коронавируса и аденовируса. Создание отредактированного аденовирусного генома для вакцины
Как же создается аденовирусная векторая вакцина? Берется геном аденовируса и из него вырезаются части (E1 и E3), которые позволяют вирусу размножаться и обходить иммунную систему (Рисунок 3 (1)). Такой вирус называется нереплицирующимся (неспособным копировать сам себя). Далее в данный вирус на место гена E1 встраивается искусственно воссозданный ген (то есть он не берется из коронавируса, а синтезируется в лабораторных условиях), кодирующий шип-белок коронавируса (2). Получается конструкция, состоящая из нереплицирующегося аденовируса с геном кодирующим шип-белок внутри, которая не способна скрывать свое нахождение в клетке от иммунной системы (3). Стоит отметить, что размножается этот вирус в специально модифицированной клеточной культуре HEK293 (есть и другие клеточные линии с лучшими характеристиками, но на сколько я знаю в основном используют именно ее), которая содержит необходимый для копирования аденовируса ген E1. Позднее, вирус отделяется и очищается от клеточной культуры и иных примесей, но так как HEK293 содержит необходимый ген есть вероятность, что вирус может «восстановить» этот ген по образцу гена из HEK293. Таким образом, аденовирус может опять стать реплицирующимся. Но в современных лабораторных условиях данный параметр ограничен и для Спутника V максимальное количество вирусных частиц, которые смогут снова реплицироваться составляет 5000 частиц на дозу (всего в одной вакцине 10e10-10e11 вирусных частиц).
Рисунок 4. Механизм действия аденовирусной векторной вакцины
Итак, мы имеем откорректированный аденовирус, из которого убраны гены E1 и E3 и добавлен ген шип-белка. Как же работает вакцина? Основной механизм работы вакцины повторяет аденовирус (Рисунок 4): вирус проникает в клетку (1, 2, 3), а потом в ядро клетки (4). Так как он не может размножаться, но может пользоваться ресурсами клетки для создания своих белков, то вирус создает только мРНК (5) и далее (6) сам шип-белок и белок аденовируса. Далее используя клеточные механизмы шип-белок с белками аденовируса оказываются на поверхности клетки (7), где их распознает иммунная система (8). Клетка также как и при коронавирусе или аденовирусе погибает от иммунной системы. Таким образом, иммунная ситема активируется также как и при обычной вирусной инфекции без побочек бесконтрольного копирования вирусного генома и маскировки от иммунной системы.
Аденовирусная векторная вакцина использует естественные механизмы активации иммунной системы. Она никак не может ослаблять иммунную систему.
Аденовирусная векторная вакцина является нереплицирующейся и поэтому не может приводить к аденовирусной инфекции, и тем более к коронавирусной (от которой ей достался только шип-белок в генетический код). К тому же инфицированные клетки уничтожаются иммунной системой и в итоге в вашем организме не остается вирусной ДНК или РНК.
Негативное влияние вакцины на плод также не находит обоснования. Если бы вакцина влияла на плод, то и любая аденовирусная инфекция это бы сделала не хуже, а даже лучше.
Шип-белок сам по себе не вызывает коронавирус. Он является всего лишь ключом, благодаря которому вирус входит в ваши клетки. А в аденовирусной векторной вакцине этот ключ еще и находится в виде молда для ключа. Причем этот молд сделан человеком, а не вирусом. То есть от вакцины невозможно подхватить коронавирус.
В случае заболевания коронавирусом или аденовирусом у вас погибает в разы больше клеток чем при вакцинации, по причине того, что вирус размножается бесконтрольно. При этом при вакцинации аденовирусный вектор локализован в основном в месте укола, а при болезни вирус разносится по всему организму.
Так как при создании вакцины берется весь геном, ответственный за создание шип-белка в коронавирусе, то в результате на поверхности клетки для распознавания иммунной системой появляется целый шип-белок. Организм не создает одну вариацию антител (моноклональность) для шип-белка, а создает множество вариаций антител (поликлональность) к разным участкам шип-белка (эпитопам). Таким образом, при вакцинации аденовирусной векторной вакциной вы также можете быть защищены (и скорее всего будете) от других штаммов вируса, у которых шип белок похож на основной штамм коронавируса. Даже если шип-белок сильно отличается (как говорят про индийский штамм) все-равно определенная защита скорее всего будет присутствовать, потому что вирус хоть и мутирует, но основные структурные элементы его остаются более-менее стабильными. Если бы шип-белок мог измениться очень сильно, то он не подошел бы к человеческому АСЕ2 рецептору и потерял бы способность заражать клетки.
В России вакцинация от коронавируса проходит в два этапа. При этом на каждом этапе вводится отдельный аденовирусный вектор (Ad5 и Ad26). В общем они похожи друг на друга за исключением деталей. Это сделано по двум причинам: у вас уже может быть иммунитет от одного типа аденовируса и второй укол усиливает ваш иммунитет. Это, конечно, создает в будущем проблему в том, что возможно нельзя будет использовать те же самые аденовирусные векторы для ревакцинации. Зато одновременно с вакцинацией от коронавируса человек может получить иммунитет к двум типам аденовирусов.
Кроме Спутник V существуют другие аденовирусные векторы от SARS-CoV-2: Oxford–AstraZeneca, Johnson & Johnson, Covidecia. Moderna и Pfizer используют мРНК-вакцину, которая отличается от аденовирусного вектора, хотя механизм активации иммунной системы тот же.
Армия США использовала живые неизмененные вирусы (серотипы Ad4 и Ad7) для вакцинации солдат от этих вирусов.
Аденовирусные векторы используются для лечения моногенетических и онкологических заболеваний
Прошу вас в обсуждениях приводить доводы, а не слухи или личные фантазии.
Да здравствует наука [Билл Гейтс, рептилоиды, жидомасоны и инопланетяне]!
Как сделать аденовирусную вакцину?
Введение: Аденовирусы и инфекции
Аденовирусы долгое время используются как инструменты в молекулярной биологии, потому что они способны переносить модифицированную ДНК, они не проявляют склонности интегрировать ДНК в человеческие геномы и умеют заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Но, как показывают вышеприведенные цифры, обратная сторона их использования в качестве терапии для людей, состоит в том, что у многих людей с самого начала могут быть антитела для борьбы с вирусным вектором, что, несомненно, снизит эффективность терапии. По этой причине ведется длительный поиск редких и необычных Ad-форм, что объясняет, почему J&J и НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи используют Ad26, Oxford / AZ использует вирус от шимпанзе (а не человеческий), ReiThera использует аденовирус гориллы и т.д. Собственно, поэтому люди задаются вопросом об общей эффективности CanSino, поскольку они используют Ad5 подтип.
Создание аденовирусного вектора
Очистка и упаковка
Выделение вирусных частиц, вероятно, устроена очень похожим образом во всех обсуждаемых вакцинах. Мне не удалось (что неудивительно) найти подробную информацию о производстве какой-либо из текущих вакцин, но, вероятно, этот этап был одним из менее сложных частей оптимизации процесса, учитывая всю работу, которая уже была проделана над аденовирусами в течение многих лет. Вы лизируете клетки культур и делаете грубую фильтрацию, чтобы пропустить вирусные частицы и удержать клеточный мусор. Согласно этой странице от AstraZeneca, похоже, что они применяют несколько этапов фильтрации, а затем используют мембранную хроматографию (вероятно, используют какой-то варианта ионообменной технологии, разделения по заряженным остаткам поверхностных белков вируса) с последующей ультрафильтрацией. Можно поспорить, что все обсуждаемые компании уже имели довольно четкое представление о том, какие именно шаги они собираются предпринять, даже если все шаги требовали некоторой настройки оптимизаций, а также верификации на каждом шаге. Соответствующие регуляторы, знают обо всех деталях, но я не думаю, что мы увидим подробности.
подробнее про то, где производятся и упаковываются аденовирусные вакцины
Я заметил, что самые ранние партии вакцины от Oxford/AZ были произведены в самом Оксфорде, а позже были произведены и упакованы компанией Advent (в Помезии, Италия) и COBRA Biologics (в Килле, Великобритания) с заправкой флаконов. от Symbiosis (в Стерлинге, Великобритания). Они работают с крупной контрактной фирмой Catalent как в США (Харманс, штат Мэриленд), так и в Европе (Ананьи, Италия) в области разлива/финализации. Также есть производство в в Нидерландах (Halix) и Бельгии (Novasep, в Seneffe). В последней фабрике, по-видимому, и наблюдались проблемы с выходом вакцины. Он также финализируется в Дессау, Германия, компанией IDT Biologika. Русский производитель R-Pharm имеет завод в Германии, производящий на экспорт в страны СНГ (там же производится вакцина НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи). Испанский Insud также задействован, как и их новый завод в Аргентине. AZ также имеет крупное производственное соглашение с Сывороточным институтом Индии, а WuXi участвует в Китае и на заводе в Вуппертале, Германия. Я уверен, что пропустил несколько сделок.
J&J, со своей стороны, имеет большие мощности в Нидерландах (например, в Лейдене), а также они подписали соглашения с Emergent на производство вакцины в Балтиморе (которые также работают с AstraZeneca и, с Novavax, которая делает пептидную вакцину на отдельном заводе в Мэриленде). Они также работают с Catalent (на их заводе в Блумингтоне, Индиана, а также на заводе Ананьи, в Италии), Reig Jofre в Барселоне, Aspen Pharmacare (в Порт-Элизабет, Южная Африка), Biological E в Индии (которые только что купили еще один завод в Химачал-Прадеше), а также с PCI Pharma для хранения и транспортировки. Без сомнения, есть и другие сделки.
Итак, теперь вы знаете про весь процесс, по крайней мере в общих чертах. Любой из этапов можно рассматривать детальнее, но по большей части текст должен дать вам базовое представление о том, что происходит (а во многих случаях, дает вам даже больше, чем вы когда-либо хотели знать!). Как видите, это принципиально иной процесс, нежели производство вакцины мРНК, со своей спецификой (хорошей и плохой). Все это может стать важным, если нам придется переоборудовать существующие вакцины-кандидаты для новых вариантов, но это тема для другого дня!
В предыдущей публикации о мРНК вакцинах, Дерек писал чуть более структурированно, но в этой статье, к сожалению, текст разделен еще меньше. Если еще дальше уходить от деталей, то этапы, приблизительно, можно разделить таким образом:
создание вирусной ДНК (обычно в бактериях)
лизис бактерий, раскрытие циклической ДНК в линейную
внедрение линейных ДНК в культуру человеческих клеток (вероятно самый сложный и капризный этап)