Что такое цитогенетическое исследование
Что такое цитогенетическое исследование или кариотипирование?
Это анализ, позволяющий установить изменения в хромосомном аппарате клеток, прежде всего, аномалии числа хромосом и наличие структурных перестроек. Цитогенетический анализ используется в диагностике многих врожденных и приобретенных заболеваний.
Обнаруженная хромосомная патология может являться причиной первичного мужского и женского бесплодия, а также тяжелых хромосомных заболеваний у детей, например, синдром Дауна (дополнительная 21 хромосома в кариотипе). Нарушения могут затрагивать и половые хромосомы. Так при синдроме Клайнфельтера в кариотипе мужчины имеется дополнительная Х хромосома.
Зачем это делается?
Цитогенетическое исследование проводятся для того, чтобы:
Многие наследственные патологии могут не проявляться на протяжении нескольких поколений. Поэтому оптимально – сдавать анализы всем супругам на этапе планирования беременности даже при отсутствии показаний.
Показания для кариотипирования
В случае наличия хотя бы одного из приведенных ниже факторов рекомендуется сдать кровь на цитогенетический анализ:
Как правильно сдавать?
Для анализа необходимы кровяные клетки. Поэтому исключают влияние разных факторов, осложняющих их рост. В противном случае результаты получаются неинформативными. Не допускается сдача крови при наличии острых заболеваний или обострении хронических. Примерно за 2 недели до предполагаемой даты отказываются от приема любых медикаментозных препаратов, в особенности антибиотиков. Употребление алкоголя, а также курение тоже нужно исключить.
Как долго проводится цитогенетический анализ?
Цитогенетический анализ обычно проводится в течение 20-30 дней с момента поступления образца в лабораторию. По результатам анализа обязательно получить консультацию врача-генетика, который даст Вам исчерпывающую информацию по данным проведенного исследования.
Что такое цитогенетическое исследование?
Цитогенетическое обследование — анализ на выявление нарушений хромосомного набора человека. Хромосомы представляют собой плотно упакованные нити ДНК, которая содержит информацию о геноме человека. Количество и структура хромосом строго специфична для каждого вида. У человека в ядрах соматических (не половых) клеток содержится в норме 46 хромосом (23 пары). Одна из пар — половые хромосомы — определяет пол человека. У женщины имеется 2 X хромосомы, такой кариотип обозначается как 46XX, у мужчины есть одна X и одна Y хромосома (кариотип 46XY). Неполовые хромосомы называются аутосомами.
Хромосомы в обычном состоянии клетки в ядре не видны, они становятся видны под микроскопом только на определенных фазах деления клеток. Для изучения кариотипа используются клетки в метафазе митоза.
Для проведения исследования у пациента берут кровь и выделяют из нее уже известные Вам лимфоциты. Для того, чтобы заставить их делиться нужна чужеродная стимуляция. Однако при кариотипировании используются специальные вещества (митогены), которые заставляют лимфоциты делиться независимо от их специфичности. В этом главное отличие от СКЛ. (Там никакие химические стимуляторы не применяются).
Через несколько дней деления культура обрабатывается специальным веществом, которое останавливает процесс деления клеток именно на той стадии, когда видны хромосомы. Из клеток культуры готовятся специальные мазки на стеклах, которые будут использованы для исследования. Для получения дополнительной информации о структуре хромосом используется специальная окраска (G-бэндинг) в результате которой каждая хромосома приобретает специфическую поперечную исчерченность. Каждая такая полоска называется G-блоком.
Теперь хромосомы полностью готовы для анализа.
Первая стадия анализа называется кариологией. В большинстве центров, производящим генетическое исследование анализ ограничивается только этой стадией. Специалист генетик анализирует под микроскопом 12-15 клеток на предмет выявления количественных и структурных аберраций. К количественным аберрациям относятся изменения числа хромосом. Например, при синдроме Дауна имеется лишняя 21-я хромосома. Структурные аберрации представляют собой изменение самих хромосом (инверсия — поворот участка хромосомы на 180., делеция — выпадение участка хромосомы, транслокация — перенос части одной хромосомы на другую хромосому, и т. д.). Аберрации могут носить регулярный и нерегулярный характер. Регулярные аберрации обнаруживаются в большом проценте клеток или во всех клетках. Они возникают в момент зачатия или в первые дни после зачатия. Нерегулярные мутации чаще всего являются свидетельством дейстия на организм неблагоприятных факторов (радиация, химические вредности и пр.).
Для выяснения следов действия вредных факторов на геном анализа 12-15 клеток бывает недостаточно (в большинстве случаев после такого анализа пациенты получают узенькую бумажку, в которой указано, что он мужчина, а она женщина).
Поэтому следующей стадией генетического обследования, которая очень важна для пациентов с бесплодием и невынашиванием беременности, является анализ на аберрации. Это расширенное генетическое обследование, при котором подробно анализируется 100 клеток, и расчитывается процент аномальных метафаз. Этот анализ хорошо выявляет возможные следы действия вредных факторов на геном человека. Из-за трудоемкости анализа (на исследование одного человека уходит целый рабочий день специалиста очень высокой квалификации) немногие медицинские центры делают анализ на аберрации.
Цитогенетическое обследование позволяет:
Что такое цитогенетическое исследование
Цитогенетическое исследование — это микроскопический анализ хромосом, результаты которого весьма важны для постановки диагноза, классификации, лечения и научного исследования заболеваний системы крови, прежде всего — онкогематологических. Значение цитогенетических методов для диагноза и лечения определяется доступностью опухолевых клеток для кариотипирования и их гетерогенностью, а с научной точки зрения — возможностью изучения изменений в структуре и функции генетических локусов, ассоциированных со злокачественной трансформацией.
Морфология хромосом сильно варьирует во время клеточного цикла. Для микроскопического анализа хромосомы должны быть визуализированы как дискретные структуры. Наилучшим образом это достигается на стадии прометафазы митоза, когда каждая хромосома видна как две идентичные хроматиды, и особенно на стадии метафазы, когда хромосомы максимально конденсированы и располагаются в одной плоскости в центре клетки отдельно одна от другой.
Нормальные клетки человека содержат 22 пары аутосом и одну пару половых хромосом: две Х-хромосомы у женщин и по одной копии половых хромосом (X и Y) у мужчин.
Для цитогенетического анализа лейкозов, миелодиспластических синдромов и хронических миелопролиферативных заболеваний исследуют клетки костного мозга. При невозможности их получения может быть исследована кровь (если она содержит бласты). Цитогенетический анализ лимфом выполняется в клетках ткани лимфатического узла. Культивирование клеток из опухоли повышает митотический индекс (пропорцию клеток, находящихся в фазе митоза) и способствует пролиферации злокачественных клеток.
Сравнительное кариотипирование нормальных клеток проводят в Т-лимфоцитах периферической крови, которые предварительно культивируют в среде с митогеном растительного происхождения — фитогемагглютинином.
Окрашивание хромосом в гематологии
В конце 1960-х годов была разработана методология дифференциального окрашивания метафазных хромосом, а в 1971 г. создана номенклатура хромосомных сегментов, позволяющая точно описывать хромосомные аномалии. Позднее были внедрены методики окрашивания менее конденсированных и, соответственно, более длинных профазных и прометафазных хромосом, которые обладают более высоким разрешением, так как позволяют визуализацию 500-2000 сегментов (метафазное окрашивание визуализирует только 300 сегментов).
Достаточно большое количество профазных и прометафазных клеток для анализа получают путем синхронизации клеточного цикла, культивируя клетки в среде, содержащей антиметаболит (например, метотрексат), который ингибирует синтез ДНК. Подавление синтеза ДНК останавливает клеточный цикл в интерфазе. Затем клетки переносят в среду без метотрексата, обогащенную тимидином, где они одновременно входят в фазу митоза. Обработка клеточной культуры колхицином останавливает митоз одновременно во всех клетках на стадии профазы или прометафазы.
Первая стойкая хромосомная аномалия при злокачественной опухоли человека была выявлена в 1960 г. у больных хроническим миелолейкозом и получила название филадельфийской хромосомы (Ph), по имени города, в котором было сделано это открытие. Применение технологии хромосомного окрашивания позволило выявить множество хромосомных аномалий, большая часть которых встречается при онкогематологических заболеваниях. Некоторые красители окрашивают различные участки хромосом с вариабельной интенсивностью в зависимости от структуры хроматина в этих участках, их нуклеотидного и белкового состава.
В результате такого окрашивания получают уникальный паттерн чередования светлых и темных поперечных полос, специфичный для каждой хромосомы.
В настоящее время существуют несколько видов дифференциального окрашивания хромосом. При Q-окрашивании акрихин-ипритом (quinacrine) или акрихиндигидрохлоридом выявляется особый тип флюоресценции каждой хромосомы с образованием Q-исчерченности (Q-banding) — поперечных флюоресцентных полос, называемых Q-полосами (Q.-bands). Это позволяет идентифицировать отдельные хромосомы. Анализ Q-полос выполняют с помощью флюоресцентного микроскопа.
Схема анализа ДНК методом FISH
При окрашивании по Гимзе (G-banding) хромосомы приобретают вид серии темных и светлых полос или бэндов (bands). G-окрашивание применяется чаще, чем Q-окрашивание, так как анализ выполняется с помощью светового микроскопа, а G-полосы, в отличие от Q-полос, не выцветают со временем. Наиболее широко применяется методика, называемая GTG-окрашиванием (G bands by trypsin using Giemsa), с предварительной обработкой трипсином.
R-бэндинг (обработка хромосом горячим спиртовым раствором перед окрашиванием по Гимзе) выявляет полосы, которые обратны G-полосам и называются R-полосами (reverse of G bands).
Помимо Q-, G- и R-окрашивания, позволяющих выявлять полосы вдоль всей длины хромосомы, существуют методики, специализированные для исследования отдельных хромосомных структур, в том числе конститутивного гетерохроматина (С-окрашивание — от англ. constitutive), теломерного района (Т-окрашивание) и района ядрышкового организатора (NOR-окрашивание — от англ. nucleolus organizing region). Размеры и положение С-полос уникальны для каждой хромосомы, но преимущественно они включают центромерныи район и используются при исследовании хромосомных транслокаций, вовлекающих центромерные районы хромосом.
Цитогенетический анализ опухолевых клеток затруднен в связи с неясной морфологией хромосом и слабой различимостью полос. Если в исследование взяты наиболее удобные для анализа метафазные пластинки, образец может быть ошибочно охарактеризован как цитогенетически нормальный.
С развитием методов рекомбинантной ДНК стало возможным использование гибридизации in situ для определения местоположения на хромосомах или в клеточном ядре любой ДНК- и РНК-последовательности. С ее помощью можно изучать и диагностировать онкологические и наследственные генетические болезни. Молекулярная гибридизация in situ является важным инструментом цитогенетических исследований, позволяет выявлять хромосомные перестройки, идентифицировать маркерные хромосомы, проводить быстрое кариотипирование клеточных линий. Важно, что подобный анализ можно проводить не только на метафазных хромосомах, но и на интерфазных ядрах.
Разрешающая способность «интерфазной цитогенетики» на два порядка выше, чем классической цитогенетики.
Несмотря на многоцелевое использование молекулярной гибридизации ДНК-ДНК (РНК) in situ, все модификации метода выполняются в соответствии с общими принципами. Существуют несколько вариантов, которые включают в себя несколько этапов: подготовка и мечение ДНК (РНК)-зонда, приготовление препаратов хромосом, собственно гибридизация, детекция гибридных молекул.
В 1980-х годах цитогенетическая методология обогатилась молекулярно-цитогенетическим методом, называемым флюоресцентной гибридизацией in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), который вскоре стал наиболее популярным. Суть этого метода заключается в гибридизации ДНК-зондов к специфическим последовательностям ДНК, меченных флюорохромами, с метафазными или интерфазными хромосомами, которые визуализируются флюоресцентной микроскопией. Определение нуклеотидной последовательности методом FISH выполняется непрямым способом, путем гибридизации синтетического олигонуклеотида (зонда) с анализируемой ДНК (называемой также матричной ДНК или ДНК-мишенью).
Если зонд синтезирован с включением флюоресцентных или антигенных молекул, которые распознаются флюоресцирующими антителами, становится возможной визуализация относительного положения зонда на анализируемой ДНК.
Флюорохром может быть связан с ДНК ковалентно (прямое мечение) или посредством иммуноцитохимических реакций, когда ДНК-зонд метят гаптеном (биотин, дигоксигенин), а флюорохром связан с алкалоидом авидином (стрептавидином), обладающим сильным сродством к биотину (или с антителами против биотина или дигоксигенина). При использовании гаптенов возможна амплификация флюоресцентного сигнала с помощью биотинилированных антител к авидину и вторичных антител, специфичных предыдущему слою антител и окрашенных флюорохромом.
Для амплификации флюоресцентного сигнала применяется метод «иммунных сэндвичей». Например, на препарат, изображенный на схеме, наносят биотинилированные антитела к авидину, а затем снова комплекс авидин-флюоресцеин. При необходимости цикл может быть повторен. Антитела в свою очередь выявляются с помощью ферментативного (например, авидинпероксидазы) или флюоресцентного детектора.
Метод FISH предназначен для выявления:
1) гибридных клеток;
2) транслокаций и других, в том числе числовых, хромосомных аномалий;
3) меченых хромосом в интерфазных и метафазных клетках.
Высококонтрастная флюоресцентная гибридизация достигается благодаря использованию флюоресцентных красителей разного цвета. С помощью двуцветной FISH выявляются тонкие структурные аномалии, например хромосомные транслокации, в том числе и неразличимые при дифференциальном окрашивании.
В настоящее время возможно выполнение многоцветной гибридизации in situ для одновременного окрашивания всех хромосом в сложном кариотипе с множественными числовыми и структурными аномалиями. Комбинация разных модифицирующих агентов и флюорохромных красителей позволяет одновременно выявлять несколько последовательностей ДНК в одном ядре (флюоресцеин дает зеленую флюоресценцию, техасский красный и родамин — красную, гидроксикумарин — голубую и т. д.). Сочетание пяти флюорохромов в разных пропорциях и компьютерный анализ изображений позволяет одновременно окрасить разным цветом все хромосомы и визуализировать 27 различных ДНК-зондов, которые служат уникальной меткой для каждой хромосомы. Эта методика называется многоцветной FISH (multicolor, или multiplex, fluorescence in situ hybridization, M-FISH).
Значение цитогенетических методов неодинаково при разных онкогематологических заболеваниях. Миелоидные клетки обычно легко кариотипируются при дифференциальном окрашивании, и FISH лишь подтверждает результаты рутинной цитогенетики. Лимфоидные клетки у больных хроническим лимфолейкозом и, особенно, множественной миеломой кариотипировать значительно сложнее из-за низкого уровня пролиферации (даже при использовании В-клеточных митогенов). В этом случае FISH демонстрирует в несколько раз большую частоту анеуплоидии, чем обычные цитогенетические методики.
Клиническое значение цитогенетических исследований
Диагноз. Потомство клетки с приобретенной цитогенетической аномалией может иметь пролиферативное преимущество и давать начало клону — клеточной популяции, происходящей от одной клетки-предшественницы. Обнаружение клональных хромосомных аномалий способствует постановке диагноза клонального поражения костного мозга. Например, цитогенетический анализ позволяет установить диагноз миелодиспластического синдрома у пациентов с умеренной цитопенией или при наличии в аспирате костного мозга минимально выраженных качественных нарушений гемопоэза.
Присутствие специфических хромосомных аномалий помогает выделить подгруппы пациентов, которым требуется специфическая терапия. Например, транслокация t(15;17)(q22;qll-21) подтверждает диагноз острого промиелоцитарного лейкоза (ОМЛ — МЗ), в комплексном лечении которого используется ретиноевая кислота.
Прогноз. Результаты цитогенетического анализа имеют не только диагностическое, но и прогностическое значение. Например, обнаружение множественных хромосомных аномалий у больных острыми лейкозами до начала лечения является прогностически неблагоприятным и служит основанием для выполнения трансплантации костного мозга или стволовых клеток периферической крови в первой полной ремиссии.
Контроль результатов лечения. Цитогенетический анализ костного мозга пациентов после проведенного лечения помогает контролировать степень элиминации опухолевого клона и, следовательно, полноту ремиссии. Выявление хромосомных аномалий, характерных для опухолевых клеток данного пациента, является ранним признаком, свидетельствующим о приближающемся рецидиве.
Цитогенетический анализ имеет большое значение в диагностике и лечении гематологических заболеваний, которое все возрастает по мере совершенствования методологии и накопления знаний об этиологической и патогенетической роли хромосомных аномалий в развитии этих болезней.
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
Что такое цитогенетическое исследование
Цитогенетическое исследование – кариотипирование – является основным методом диагностики хромосомных нарушений и проводится в целях выявления нарушений количества и структуры хромосом. Используется для пренатальной диагностики.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Кариотипирование – цитогенетическое исследование, изучение хромосомного набора человека, позволяющее обнаружить отклонения в структуре и числе хромосом. Оно помогает выявить нарушения хромосом, вероятно, не влияющие на здоровье человека, но тем не менее важные для планирования будущей беременности и для здоровья будущего ребенка (патологии плода, аномалии развития).
Кариотип – это полный хромосомный набор клетки человека. В норме он состоит из 46 хромосом, из них 44 аутосомы (22 пары), имеющих одинаковое строение и в мужском, и в женском организме, и одна пара половых хромосом (XY у мужчин и XX у женщин). Каждая хромосома несет гены, ответственные за наследственность. Кариотип 46, ХХ – соответствует нормальному женскому кариотипу, а кариотип 46, XY – это нормальный мужской кариотип. Кариотип остается неизменным в течение всей жизни.
Нарушения хромосомного набора могут являться причиной наследственной патологии, бесплодия, невынашивания беременности, рождения ребенка с различными пороками развития.
Для цитогенетического исследования хромосом чаще всего используют препараты кратковременной культуры крови, реже клетки костного мозга и культуры фибробластов.
Кариотипирование культуры лимфоцитов периферической крови человека – сложное многоступенчатое цитогенетическое исследование, проводится, когда клетки входят в фазу митоза – непрямого деления с тождественным распределением генетического материала между дочерними клетками. Оно включает в себя следующие этапы:
Различают несколько видов нарушений структуры хромосом:
Хромосомные нарушенияразличаются также по принципу регулярности. Регулярные мутации присутствуют при делении каждой клетки или большинства клеток. Они проявляются в момент зачатия плода либо в первые несколько дней беременности. Нерегулярные аберрации появляются в результате негативного воздействия радиации, химических средств и т.д.
Нарушение расхождения хромосом может произойти во время клеточного деления (мейоза). Если такое нарушение происходит в процессе образования сперматозоидов или яйцеклеток, то в половой клетке появляется лишняя хромосома, которая при зачатии будет передана ребенку. В результате она будет присутствовать во всех клетках организма ребенка. Примером трисомии может служить синдром Дауна (лишняя 21-я хромосома) или синдром Патау (трисомия 13-й хромосомы). Также нарушение расхождения хромосом может произойти при первых делениях оплодотворенной яйцеклетки. Например, утрата Х-хромосомы приводит к развитию Х0-синдрома, или синдрома Шерешевского – Тернера. Аномалии, связанные с нарушением расхождения хромосом, встречаются не так часто, поэтому вероятность их повторения в одной и той же семье достаточно мала.
Структурные же нарушения хромосом передаются по наследству, при этом степень семейного риска и дальнейшая передача дефекта от поколения к поколению становится значительно высокой.
Кариотипирование также рекомендуют проводить в тех семьях, где есть высокая вероятность рождения ребенка с болезнью, сцепленной с Х-хромосомой.
Когда назначается исследование?
Показания для кариотипирования супружеских пар:
Показания для кариотипирования детей:
Что означают результаты?
Для мужчин нормальным считается кариотип 46,XY. Это означает, что определено 46 нормальных хромосом, в том числе X и Y хромосома.
Для женщин нормальным считается кариотип 46,XX. Это означает, что определено 46 нормальных хромосом, в том числе две X хромосомы.
В случае выявления патологического кариотипа, необходима консультация медицинского генетика по результатам исследования для правильной его интерпретации.
Что такое цитогенетическое исследование
Цитогенетический анализ клеток костного мозга (кариотип) – исследование, целью которого является оценка количества и структуры хромосом клеток кроветворной ткани.
Стандартное кариотипирование клеток костного мозга, стандартная цитогенетика в метафазных пластинках.
Chromosome Analysis, Bone Marrow, Karyotype, Cytogenetics, Cytogenetic Analysis, Chromosome Studies, Chromosome Karyotype.
Дифференциальное окрашивание хромосом.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Общая информация об исследовании
Взятие костного мозга для исследования проводится посредством пункции кости. Манипуляцию выполняет врач. Чаще всего костный мозг аспирируется из грудины или задних остей подвздошных костей. После выбора места пункции и обработки кожи над ним раствором антисептика врач проводит послойную местную анестезию до надкостницы. После введения анестетика ждут наступления анестезии не менее одной минуты. Пункцию выполняют специальной иглой, которая имеет внутри стержень. Её продвигают сквозь мягкие ткани до надкостницы, затем с усилием внедряют вглубь костного вещества. После этого убирают стержень и шприцем набирают костный мозг. Во время аспирации возможно возникновение болевых ощущений из-за перепада давления в полости кости. Полученный костный мозг переливают в вакутейнер, содержащий гепарин натрия, и отправляют в лабораторию.
Большинство опухолей кроветворной системы связаны с возникновением генетических изменений в столовой клетке крови, которые приводят к её злокачественной трансформации и появлению опухолевого клона. Генетические нарушения специфичны для определенного заболевания, поэтому их обнаружение считается достоверным диагностическим критерием. Кроме того, наличие некоторых генетических аномалий может влиять на прогноз заболевания, его чувствительность к тем или иным способам лечения и, соответственно, помогает выбрать наилучшую тактику терапии. Стандартное цитогенетическое исследование клеток костного мозга представляет собой изучение количества и структуры хромосом клеток и позволяет выявить геномные (нарушения в количестве хромосом) и хромосомные (изменения в их структуре) мутации.
Хромосомы – структуры в ядре клетки, в которых компактно собрана генетическая информация в виде ДНК. Когда клетка находится в состоянии покоя, хромомосы упакованы в клеточном ядре и визуально различить их друг от друга невозможно. Однако в одну из фаз деления клетки, которая называется метафаза, хромосомы выстраиваются в одну плоскость в центре клетки, формируя так называемую метафазную пластинку. Именно такие метафазные пластинки и изучаются в процессе цитогенетического исследования. Кроветворные клетки костного мозга постоянно делятся, поэтому часть из них во время взятия как раз будет находиться в метафазе своего деления. Преимущество такого метода цитогенетического исследования в том, что оно не требует дополнительных воздействий на клетки для стимуляции деления и получения метафаз. После обработки биоматериала различными химическими веществами клетки фиксируют на предметных стеклах и производят окраску. Существует несколько методов окраски хромосом, каждый из которых позволяет лучше дифференцировать те или иные особенности их строения. Хромосомы анализируется как с помощью микроскопа, так и с использованием компьютерных аналитических систем, которые существенно повышают качество и скорость исследования.
Кариотипирование проводится как минимум на двадцати хорошо окрашенных, полных метафазных пластинках с хорошим разбросом хромосом. Исследователь подсчитывает их количество и проводит оценку структуры каждой путем сопоставления двух аналогичных хромосом и сравнения их с цитогенетическими картами.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Нормальный кариотип человека выглядит следующим образом:
46,ХХ – нормальный кариотип женщины,
46,XY – нормальный кариотип мужчины,
Количество проанализированных метафаз, а также метафаз, в которых выявлены мутации, записывается в квадратных скобках. Для записи генетических аномалий существуют специальные правила, соответственно которым будет написан результат исследования при выявлении какой-либо мутации.
Количественные аномалии хромосом записываются как их общее число, перечисление половых хромосом и номер отсутствующей или лишней хромосомы с соответствующим знаком минус или плюс.
Для обозначения структурных аномалий используются специальные буквенные символы:
t – транслокация – участок одной хромосомы переносится на другую,
del – делеция – потеря участка хромосомы,
inv – инверсия – поворот участка хромосомы на 180 градусов,
— после которых указывается номер хромосомы, на которой они обнаружены, а также ее участок.
В заключении цитогенетического исследования содержится информация о виде мутации и доле метафазных пластинок, в которой она выявлена.
Что может влиять на результат?
Кто назначает исследование?