что такое расширенный геном
Новый взгляд на геном: не просто цепочка генов, а трехмерная сеть, интегрирующая функциональные домены ядра
«Не то, что мните вы, геномы». На самом деле геном — не просто абстрактная цепочка генов, а сложнейшая трехмерная структура, динамически сворачивающаяся и разворачивающаяся в зависимости от текущего состояния клетки.
Автор
Редакторы
Редакция журнала «Биохимия» и «Биомолекула» предлагают вашему вниманию специальный выпуск журнала, посвященный 3D-организации генома, функциональной компартментализации клеточного ядра и регуляции транскрипции. В выпуске представлены статьи ведущих отечественных и ряда зарубежных ученых, которые кратко резюмирует «Биомолекула». Большое внимание уделяется значению стохастических процессов в установлении 3D-архитектуры генома и эпигенетической роли пространственной организации генома.
«Биохимия» — «Биомолекуле»
Выдающийся франко-швейцарский ученый Вильгельм Бернард (Wilhelm Bernhard) уже в 70-е годы прошлого века осознал, что необходимо интегрировать в единое научное направление цитологию и биохимию, фактически предвосхитив появление научного направления, которое теперь мы называем «молекулярная и клеточная биология». Именно продвижению этой идеи должны были способствовать созданные по инициативе Вильгельма Бернарда регулярные конференции по структуре и функциям клеточного ядра. В прошлом году прошла такая и в России: 19–22 июня 2017 года в Нижнем Новгороде состоялся уже 25-й симпозиум из этой серии.
В 70-е годы прошлого века биохимики рассматривали клеточное ядро как некий реакционный компартмент, в котором сосредоточены молекулы наследственности (ДНК) и ферменты, необходимые для ее удвоения и считывания информации в виде молекул РНК. Происходящие в клеточном ядре процессы пытались понять на основе знаний о кинетике ферментативных реакций в растворе. Будучи специалистом по электронной микроскопии, Вильгельм Бернард хорошо осознавал, что клеточное ядро неоднородно. Соответственно, скорее следовало говорить о том, что оно представляет собой не единый реакционный компартмент, а совокупность относительно изолированных областей.
Эта идея нашла многочисленные подтверждения в последующих исследованиях, которые продемонстрировали, что различные функциональные процессы в клеточном ядре пространственно изолированы. Например, показали, что работающие РНК- и ДНК-полимеразы собраны в кластеры, получившие название транскрипционных и репликационных фабрик [1], [2]. Обнаружили многочисленные внутриядерные компартменты, в которых сосредоточены те или иные ферменты. Наконец, коллектив немецких ученых под руководством Томаса Кремера (Thomas Cremer) продемонстрировал, что в интерфазном ядре индивидуальные хромосомы занимают обособленные (не перекрывающиеся) позиции, получившие название хромосомных территорий [3–5].
Как только научный мир признал факт существования структурно-функциональной компартментализации клеточного ядра, встал вопрос о том, существует ли какая-то структурная платформа, поддерживающая эту компартментализацию. В цитоплазме такой платформой является цитоскелет. Начальные наблюдения, сделанные еще в 1960-х годах рядом ученых, в том числе в России Ильёй Борисовичем Збарским, свидетельствовали о том, что подобная цитоскелету белковая структура существует и в клеточном ядре. Американский ученый Рональд Березни (Ronald Berezney) назвал эту структуру ядерным матриксом. Изучение ядерного матрикса сыграло важную роль в развитии современных представлений о компартментализации клеточного ядра. Многие из наблюдений, сделанных при изучении ядерного матрикса, актуальны и сейчас. Об этом рассказывается в заключительной части статьи Сергея Разина и Алексея Гаврилова в специальном выпуске журнала «Биохимия» [6]. Тем не менее никаких убедительных доказательств существования этой структуры в живых клетках получено не было. Сеть внутриядерных белковых филаментов, которую можно увидеть при электронномикроскопическом исследовании ядер после экстракции хроматина, скорее всего, возникает в результате агрегации белков в интерхроматиновых каналах.
Что же тогда является платформой, на которой собираются функциональные компартменты клеточного ядра? Современная гипотеза состоит в том, что этой платформой является сам упакованный геном. В ее обоснование ключевой вклад внесли работы Томаса Кремера и соавторов, о которых рассказывается в их обзорной статье в спецвыпуске журнала «Биохимия» [7]. Работы этой группы ученых начались с поиска ответа на вопрос: что происходит с хромосомами по завершении митоза? Все знают, что во время митоза пары хромосом имеют вид конденсированных палочек, связанных перетяжками в центромерных областях. А вот что происходит с ними по завершении этого процесса, долгое время оставалось неясным.
Клеточное ядро подобно фабрике, где выполнение отдельных процессов разделено во времени и пространстве
В 70-е годы прошлого века наиболее популярная точка зрения состояла в том, что по завершении митоза хромосомы полностью деконденсируются, распределяясь по всему объему ядра и перемешиваясь с другими хромосомами. Томас Кремер и соавторы сделали простой эксперимент. Они повредили небольшую область клеточного ядра с помощью направленного пучка ультрафиолетового света. Существует техническая возможность посмотреть во время следующего митоза, какие из хромосом оказались повреждены. Если бы ДНК каждой хромосомы была распределена по всему объему ядра, то можно было бы ожидать, что повредятся все хромосомы. Однако на деле поврежденными оказывались лишь несколько хромосом. Это позволило заключить, что хромосомы занимают ограниченные области внутри клеточного ядра.
Как и вообще в науке, дальнейший прогресс в этих исследованиях был обусловлен развитием экспериментальных технологий. С появлением конфокальной микроскопии [8] и методов визуализации индивидуальных хромосом посредством флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с наборами хромосом-специфичных проб, удалось показать, что интерфазные хромосомы действительно занимают ограниченные и в первом приближении неперекрывающиеся области, получившие название «хромосомные территории» (рис. 1).
Рисунок 1. Каждой хромосоме — свою территорию. Большие хромосомы курицы окрашены наборами разноцветных флуоресцентных хромосом-специфичных проб. Слева показана окраска хромосом в метафазе, а справа — в интерфазном ядре. Можно видеть, что хромосомы занимают неперекрывающиеся области ядра.
Между хромосомными территориями находится так называемый интерхроматиновый домен, а внутри него располагаются различные функциональные компартменты, о которых говорилось выше. Хромосомные территории в каждом ядре позиционируются посредством прикрепления к ядерной оболочке (ламине) и ядрышку (рис. 2). Кроме того, существуют и «сцепки» между хромосомными территориями, возникающие благодаря тому, что некоторые участки разных хромосом привлекаются к одним и тем же функциональным компартментам (транскрипционным фабрикам, компартментам сплайстинга и т.д.) в интерхроматиновом домене. В силу этого возникает единый и при этом относительно «жесткий» хроматиновый домен, который и служит структурной платформой для всей внутриядерной организации.
Рисунок 2. Хроматиновый компартмент и интерхроматиновый домен. Отдельные хромосомные территории (показаны разными цветами) прикрепляются к ядрышку и ядерной ламине. В ряде мест хромосомные территории контактируют друг с другом, в силу чего формируется единый хроматиновый компартмент. Интерхроматиновым доменом являются относительно свободные от хроматина места между хромосомными территориями, а также полости (каналы), пронизывающие хромосомные территории.
Модель хромосомных территорий и интерхроматинового домена сформулировал Томас Кремер в конце 80-х годов прошлого века, и в последующие годы ее совершенствовали и уточняли по мере появления новых экспериментальных данных. В статье Томаса Кремера и соавторов, опубликованной в спецвыпуске журнала «Биохимия» [7], представлена современная версия модели, учитывающая последние результаты авторов, полученные с использованием микроскопии высокого и сверхвысокого разрешения (SIM, STORM) [9], [10].
Наиболее важные уточнения состоят в том, что интерхроматиновые каналы пронизывают хромосомные территории. Последние представляют собой свернутую цепочку из глобулярных хроматиновых доменов (содержащих
1 млн пар нуклеотидов ДНК), которые иногда организованы в кластеры. Существенно, что внутренние области таких глобулярных доменов содержат преимущественно неактивный хроматин, тогда как транскрибирующиеся гены находятся на поверхности глобулярных доменов в так называемом перихроматиновом слое (рис. 3). Эта организация обеспечивает предпочтительную доступность транскрипционноактивной фракции генома для регуляторных белков и аппарата транскрипции. Одновременно обеспечивается возможность транспорта новосинтезированных РНК к ядерным порам по сети интерхроматиновых каналов.
Возникновение 3D-геномики
Работы коллектива исследователей, возглавляемого Томасом Кремером, раскрыли важные особенности структурно-функциональной организации клеточного ядра. Однако ультраструктурные исследования в принципе не могут дать ответа на вопрос о том, как устанавливается и поддерживается пространственная организация генома. В раскрытии механизмов, поддерживающих пространственную организация эукариотического генома, а стало быть и структурно-функциональную компартментализацию клеточного ядра, ключевую роль сыграли работы молекулярных биологов, выполненные на протяжении последних 15 лет. Результаты этих работ анализируются в обзорной статье Разина и Гаврилова, опубликованной в спецвыпуске журнала «Биохимия» [6].
Ключевой инструмент, позволивший изучать 3D-организацию генома, — процедура лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК, разработанная американским ученым Джобом Деккером (Job Dekker). Нить ДНК разрезается на фрагменты внутри фиксированных формальдегидом ядер, и возникающие свободные концы ДНК вновь сшивают с помощью ДНК-лигаз. При этом во многих случаях восстанавливается целостность исходной цепи ДНК, однако возможна и перекрестная сшивка фрагментов, физически расположенных рядом, но разнесенных далеко друг от друга на молекуле ДНК. Такое может произойти в случае петель на ДНК: фрагменты нити, расположенные в основании петли, сближены друг с другом.
На основе процедуры лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК разработан ряд экспериментальных протоколов, адаптированных для решения разных задач и в совокупности именуемых С-методами (от названия исходной процедуры — Chromosome Conformation Capture; сокращенно — 3C). Принцип одного из этих методов — Hi-C, позволяющего строить полногеномные профили пространственных взаимодействий удаленных фрагментов ДНК, — показан на рисунке 4.
Рисунок 4. Принцип метода Hi-C. Конфигурация хроматиновой фибриллы в ядре фиксируют формальдегидом. После экстракции непришитых гистонов ДНК разрезают рестриктазой и застраивают липкие концы с использованием биотинилированного предшественника. Далее проводят лигирование. При этом возможно образование сшивок между отдаленными фрагментами ДНК, которые оказались сближены в силу особенностей укладки хроматиновой фибриллы. Сшитые фрагменты выделяют посредством аффинной хроматографии на шариках со стрептавидином, который специфически связывает биотин. Полученный препарат секвенируют и результаты накладывают на референсный геном. Получаемая в итоге «тепловая карта» позволяет судить о частотах контактов между удаленными геномными элементами. На приведенной в секции B тепловой карте красный цвет соответствует наиболее высокой частоте пространственных взаимодействий. Выраженные треугольники на карте свидетельствуют о существовании контактных доменов, внутри которых пространственные взаимодействия наблюдаются намного чаще, чем между доменами. Контактные домены обычно отождествляют с хроматиновыми глобулами, хотя убедительные свидетельства в пользу такой интерпретации появились лишь недавно [11].
1 м.п.н. Основной характеристикой ТАДов является то, что пространственные контакты внутри ТАДа происходят существенно чаще, чем между ними. Это может происходить, например, в том случае, когда в границах ТАДа хроматиновая фибрилла организована в компактную глобулу. Легко видеть возможное соответствие ТАДов глобулярным доменам, которые обнаружили Томас Кремер и соавторы. Действительно, визуализация индивидуальных ТАДов с использованием техники FISH и микроскопии высокого разрешения продемонстрировала, что ТАДы обычно имеют глобулярную форму.
Также с помощью методики Hi-C были раскрыты подробности «молекулярных путешествий» некодирующей РНК Xist, функция которой — инактивация некоторых генов на X-хромосоме: «Загадочное путешествие некодирующей РНК Xist по X-хромосоме» [12]. — Ред.
Рисунок 5. Как работают энхансеры: удаленные от своего промотора в последовательности ДНК, они могут быть сближены в пространстве. Вверху — На линейной ДНК ген, расположенный далеко от энхансера, оказывается вне зоны действия энхансера. Слева — Выпетливание разделяющего энхансер и промотор сегмента хроматиновой фибриллы перемещает промотор в сферу действия энхансера (область, ограниченная пунктиром). Справа — На уровне 3D-организации генома один ген может оказаться в сфере действия нескольких энхансеров.
Помимо организации в ТАДы, характерной особенностью упаковки эукариотических геномов является существование большого количества хроматиновых петель различного рода. Из них с функциональной точки зрения наибольший интерес представляют выпетливания хроматиновой фибриллы, обеспечивающие приближение энхансеров к промоторам. В свете этих результатов стало очевидным, что на уровне 3D-организации генома работают важные эпигенетические механизмы, контролирующие транскрипцию [13].
На подсознательном уровне большинство людей, в том числе и ученых-биологов, все еще рассматривают геном как линейную цепь генов и регуляторных элементов. Трендом времени является, однако, представление о геноме как о трехмерной структуре, обеспечивающей возможность установления контактов между генами и удаленными регуляторными элементами. Сейчас известно, что в геноме человека количество регуляторных модулей (энхансеров) в разы превышает количество генов [14], [15]. Именно трехмерная организация генома обеспечивает возможность активации тех или иных генов одновременно несколькими энхансерами в различных комбинациях (рис. 5), что позволяет системе регуляции транскрипции лучше адаптироваться к изменяющимся потребностям клетки.
Осознание этого факта привело к возникновению 3D-геномики, которая позволяет объяснить многие непонятные ранее феномены. Ясно, что организация генома в ТАДы накладывает определенные ограничения на возможность установления пространственных контактов между удаленными регуляторными элементами. Такие контакты, как правило, устанавливаются внутри ТАДов. В силу этого сфера активности энхансеров часто ограничивается пределами соответствующего ТАДа. Слияние ТАДов или возникновение новых ТАДов в результате хромосомных перестроек (таких, как делеции и инверсии) может привести к нарушению работы большого числа генов и, как уже показано, является причиной возникновения ряда наследственных заболеваний. Обо всем этом можно прочитать в статье Разина и Гаврилова в спецвыпуске журнала «Биохимия» [6].
От констатации фактов к раскрытию механизмов
Учитывая очевидную функциональную роль 3D-организации генома, важно понять, как эта организация складывается и какие силы ее поддерживают. Что касается ТАДов, то существуют две не исключающие друг друга модели. Одна из них, которую можно назвать моделью динамического выпетливания ДНК (DNA loop extrusion), постулирует, что в сегментах генома, ограниченных конвергентными сайтами связывания архитектурного белка CTCF, происходит динамическое выпетливание хроматиновой фибриллы, которое может начаться в любой точке и продолжается до сайта связывания CTCF. В результате в разных клетках рядом оказываются разные участки данной области генома. При интеграции данных по клеточной популяции получается домен, внутри которого предпочтительно реализуются пространственные контакты ДНК. Эта модель подробно обсуждается в недавней статье на «Биомолекуле»: «Организовать геном: запутанная история гипотез и экспериментов» [16].
Недостатком модели является то, что ТАД представляется популяционным феноменом, в то время как хроматиновые глобулы можно видеть в индивидуальных клетках. Другая модель, предложенная отечественными учеными, постулирует, что ТАДы — это компактные хроматиновые домены, существующие в индивидуальных клетках [17]. Движущей силой, обеспечивающей возникновение таких доменов, представляется электростатическое взаимодействие между нуклеосомами неактивного хроматина. Эта модель хорошо согласуется с описанными выше результатами Томаса Кремера и соавторов, но не объясняет предпочтительной локализации конвергентных сайтов связывания CTCF на границах ТАДов в клетках млекопитающих.
Роль стохастических процессов в клеточном ядре — как хаос порождает порядок
Рисунок 6. Энтропийные силы, возникающие в условиях макромолекулярного скопления, способствуют созданию макромолекулярных агрегатов. Находясь в постоянном температурном движении, малые молекулы бомбардируют более крупные молекулярные комплексы с разных направлений. В том случае, если по стечению обстоятельств два крупных объекта окажутся рядом, микромолекулы не смогут бомбардировать их со стороны контактирующих поверхностей, в силу чего крупные объекты будут постепенно объединяться в еще более крупные агрегаты, подобно мусору на поверхности воды. Кроме того, объединение двух крупных объектов сокращает так называемый исключенный объем (зеленые короны вокруг крупных объектов), что дает выигрыш в энтропии. Связанные с ДНК макромолекулярные комплексы также будут объединяться под действием энтропийных сил, что может приводить к образованию петель ДНК.
Кажущимся недостатком всех моделей пространственной организации ТАДов является то, что поддержание 3D-организации генома обеспечивается относительно слабыми взаимодействиями. В какой-то мере все эти модели похожи на создание трехмерной конструкции из водопроводных труб, удерживаемых пластилином. Впрочем, роль слабых взаимодействий в молекулярной биологии не стоит недооценивать: об этом идет речь в статье «Роль слабых взаимодействий в биополимерах» на «Биомолекуле» [18].
В клеточном ядре существуют силы, способствующие удержанию вместе крупных объектов, которые стабилизируют 3D-геном и внутриядерные компартменты. Об этих силах рассказывается в статье Рональда Хэнкока (Ronald Hancock) [19]. Он одним из первых обратил внимание на то, что концентрация макромолекул в ядре столь высока, что она соответствует условиям макромолекулярного скопления. В этих условиях термодинамически выгодным оказывается объединение крупных объектов в еще более крупные агрегаты (рис. 6). В крайних случаях при этом происходит разделение фаз [20]. Так возникают различные ядерные компартменты, в том числе ядрышко, спеклы сплайсинга, тельца Кахаля и т.д. Эти компартменты не окружены мембранами и существуют до тех пор, пока выполняются условия макромолекулярного скопления. Хэнкок продемонстрировал, что все эти компартменты можно разбирать и собирать вновь, изменяя уровень макромолекулярного скопления. Энтропийные силы, возникающие в этих условиях, поддерживают и компактную организацию различных хроматиновых структур, таких как метафазные хромосомы, гетерохроматиновые кластеры и глобулярные хроматиновые домены (ТАДы) в составе интерфазных хромосом.
В контексте 3D-геномики возможно совершенно новое объяснение биологической роли бессмысленных, на первый взгляд, участков нуклеотидной последовательности. Не кодируя никакие белки, эти участки генома могут, тем не менее, существенно влиять на транскрипцию тех или иных генов, модулируя способ пространственной укладки протяженных областей генома. Конкретные механизмы такого влияния еще предстоит выяснить. Это может стать ключом к раскрытию возможной роли повторяющихся последовательностей в работе генома. В этой связи в спецвыпуск журнала «Биохимия» включена статья Ольги Подгорной и соавторов, в которой суммируются современные знания, включая и результаты собственных работ авторов, о повторяющихся последовательностях генома млекопитающих [21].
Человек генно-модифицированный / Homo genere mutatio
Человек генно-модифицированный / Homo genere mutatio
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Когда Олдос Хаксли писал «Дивный новый мир», думал ли он, что на самом деле может наступить эра детей, созданных по заказу? «Дети здесь не рождаются. Их выращивают в специальных инкубаторах и делят на альфы, беты, гаммы, дельты и эпсилоны в зависимости от умственных способностей». На сегодняшний день вряд ли найдется более рьяно обсуждаемая в СМИ тема биомедицины, чем CRISPR/Cas. СМИ готовят общество к появлению в будущем фабрик по производству детей на заказ, ученые — к возможности создания генетической панацеи. Исследования на человеческих эмбрионах с применением генетических модификаций лишь подливают масла в огонь. Общественность строит догадки, какие перспективы дает этот инструмент генного редактирования в руках ученых. Ждет ли мир появление «отредактированных» людей? Станет ли Homo genere mutatio в эволюционный ряд после Homo sapiens sapiens? К чему бы ни привела технология CRISPR/Cas, несомненно, что это шаг в бездну новых возможностей.
Конкурс «био/мол/текст»-2017
Эта работа опубликована в номинации «Биомедицина сегодня и завтра» конкурса «био/мол/текст»-2017.
Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Спонсором приза зрительских симпатий и партнером номинации «Биомедицина сегодня и завтра» выступила фирма «Инвитро».
Что такое CRISPR/Cas9 и с чем его едят
Хотя система CRISPR известна с 1980-х, активно о ней заговорили лишь несколько лет назад [1]. Повышенное внимание к технологии генной модификации связано с перспективами, которые она открывает. В частности, лечение генетических заболеваний. Это может изменить медицину. Освоение CRISPR/Cas9 в рамках человеческого тела подобно первым шагам в космосе.
Технология CRISPR (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) основана на направленном редактировании генома с помощью эндонуклеазы Cas9. Словно умные ножницы, фермент Cas9 совершает двунитевые разрезы в нужных участках гена, удаляя дефекты генетической информации (рис. 1). После того как разрыв внесен, включаются системы восстановления ДНК, и нужная неповрежденная последовательность встает на место удаленной дефектной [2].
Рисунок 1. Схема работы CRISPR/Cas9.
Это уже не совсем так. В начале ноября 2017 года появилось сообщение о том, что мальчику, больному буллезным эпидермолизом, заменили 80% площади кожи на трансплантаты из его собственных клеток, в которых дефектный ген, вызывающий болезнь, заменили нормальным. — Ред.
Рисунок 2. Общественное мнение относительно технологии CRISPR/Cas9.
Другой стороной медали может стать использование технологии не по задуманному назначению. Общество страшится появления «дизайнерских» детей, сделанных на заказ родителями. Проведенный опрос среди американцев говорит о том, что люди еще не готовы принять возможности генной терапии. Так, 83% респондентов не хотят использовать технологию для совершенствования детей (рис 2).
Еще один шаг к совершенству
Однако технология генного «ремонтирования» не без изъянов. Она не доведена до совершенства. CRISPR/Cas9 — это не волшебная палочка, призванная исправлять любой генетический дефект. Генетический скальпель не отличается высоким уровнем точности. Эндонуклеаза может совершить разрезы и в нецелевых участках. При этом система CRISPR/Cas9 может не исправлять мутации, как задумывалось, а создавать новые.
Отсутствие стопроцентной точности в работе эндонуклеазы Cas9 делает технологию небезопасной и ненадежной. Пока система не станет более точной, она не получит широкое распространение в практической медицине. Однако маленькие шаги в сторону реальности метода совершаются. Работа ученых из Массачусетского технологического института выводит технологию CRISPR на новый уровень посредством создания улучшенной версии фермента — eSpCas9.
eSpCas9 имеет повышенную специфичность, что снижает вероятность побочных эффектов при редактировании генома. Разрезы этого фермента более точные. Это позволило снизить риск вероятных ошибок примерно в 10 раз. Несомненно, такое открытие — настоящий прорыв для генного редактирования. Оно стало более специфичным и точным, а значит, стало ближе к практической медицине, чем когда-либо [3].
Первый блин комом
В апреле 2015 года мир должен был ахнуть от удивления: впервые ученым удалось не просто прочитать, а еще и отредактировать геном человека (рис. 3). Удивительно, но это событие не привлекло к себе много внимания. Такие авторитетные издания, как Nature и Science, не пожелали публиковать данные об исследовании ввиду его неэтичности. Связано это с тем, что впервые методику генного редактирования CRISPR/Cas9 проверили на человеческих эмбрионах [4].
Рисунок 3. Человеческие эмбрионы с отредактированным геномом.
Китайские ученые из университета Гуанчжоу использовали нежизнеспособные эмбрионы. Их получили посредством ЭКО. На этапе их образования произошел сбой, который привел к формированию трипронуклеарных эмбрионов, которые содержат не два пронуклеуса — материнский и отцовский, — а три. Такие зародыши обычно погибают еще до имплантации и нежизнеспособны: они содержат аномальный тройной набор хромосом (69 шт.), тогда как в норме кариотип составляют 46 [5]. Лишние 23 хромосомы не дают плоду развиваться нормально, что приводит к его гибели [6].
Перед учеными не стояла задача продлить время жизни трипронуклеарных эмбрионов. Их целью было осуществить генный нокаут бета-талассемии, которой страдали эмбрионы. Задумку не вполне удалось реализовать. Из 86-и лишь полсотни эмбрионов удалось протестировать. Генная модификация произошла в 28 зародышах, но почти во всех случаях — не такая, как надо, или в неправильном месте. Дефектный ген бета-талассемии был успешно удален из клеток лишь четырех эмбрионов.
Эксперимент не только не принес ожидаемого эффекта, но и создал новые непредвиденные мутации в геноме множества клеток. По словам лидера научной группы, использованная технология пока слишком «сырая». Она не может быть использована на нормальных эмбрионах. Чтобы приступить к ее клиническому использованию, процент успеха должен приближаться к 100.
Модификация людей одобрена законом
Официальное разрешение от вневедомственного органа Министерства здравоохранения Соединенного Королевства — HFEA (Human fertilisation and embryology authority) — на редактирование человеческих эмбрионов с помощью технологии CRISPR/Cas9 в 2016 году получила исследовательская группа из Института Фрэнсиса Крика в Великобритании под руководством биолога Кэти Ниакан. В качестве объекта исследования будут использоваться лишние эмбрионы, которые получают при ЭКО, — те, что оказались не нужны семьям ввиду свершившегося успешного подсаживания других зародышей. Раньше такой материал просто утилизировали за ненадобностью.
Это первое разрешение на подобную деятельность в Великобритании, и ученых не ждет полная свобода действий. Эмбрионы могут быть использованы лишь для определенных целей, которые будут оценены экспертной комиссией (рис. 4). Применять можно семидневные эмбрионы. Срок жизни объектов исследования после начала эксперимента — 14 дней. После этого они должны быть утилизированы. Подсаживание их к суррогатной матери исключено. Пролонгировать беременность генномодифицированными эмбрионами запрещено [7].
Рисунок 4. Человеческому эмбриону вводят отредактированную ДНК в лондонской лаборатории Института Фрэнсиса Крика.
Успех CRISPR/Cas9
Первые полосы научных журналов в августе 2017 года вновь украшала аббревиатура CRISPR/Cas9. На этот раз новостями об успешном эксперименте спешили поделиться ученые из Орегонского университета здоровья и науки (OHSU). Группа ученых во главе с уроженцем Казахстана Шухратом Миталиповым применили технологии редактирования генов CRISPR/Cas9, чтобы изменить ДНК больных человеческих эмбрионов [8].
Среди безумного моря наследственных патологий выбор объекта исследования пал на гипертрофическую кардиомиопатию. Это серьезное генетическое заболевание сердца с аутосомно-доминантным типом наследования. Это значит, что патология проявится при наличии хотя бы одной дефектной копии гена. При этом данный ген не сцеплен с половой хромосомой, поэтому встречается как у мужчин, так и у женщин.
Особенно часто заболевание поражает молодых спортсменов [9]. Технология CRISPR/Cas9 позволила группе ученых отредактировать дефектный ген. В исследовании использовали 12 здоровых яйцеклеток и сперму, несущую мутантный ген MYBPC3. С помощью CRISPR/Cas9 из ДНК сперматозоидов удалось вырезать дефект, словно ножницами (рис. 5) [10].
Рисунок 5. Схема воздействия CRISPR/Cas9 на ген MYBPC3.
В результате получили 42 здоровых эмбриона из 58-и. Это составило 72,4% потомства без патологии. Такие результаты оказались довольно успешными по сравнению с полученными ранее при других исследованиях с CRISPR/Cas9 на эмбрионах с генетическими заболеваниями. Улучшение показателей, их приближение к ста процентам, дает надежду на лечение наследственных болезней в ближайшем будущем.
«Мы продемонстрировали возможность исправлять мутации в человеческом эмбрионе безопасным способом и с заметной степенью эффективности», — говорит один из руководителей проекта, Хуан Карлос Бельмонте.
Что может предложить миру CRISPR/Cas9
Каждое крупное открытие в истории человечества встречало сопротивление. С этим столкнулись и Галилео Галилей, и Джордано Бруно, и Парацельс, и Игнац Земмельвейс, осмеянный за свое предложение мыть врачам руки перед осмотром больных. Мир с трудом принимает новые открытия. Сотни известных имен стали признанными лишь после смерти и были гонимы за свои убеждения при жизни.
Инквизиция и научное невежество остались далеко позади. Сегодня медицина развивается очень быстро — в сравнении с минувшими столетиями она движется семимильными шагами. Несомненно, CRISPR/Cas9 станет одним из важнейших биотехнологических открытий XXI века. Что же может предложить миру эта технология?
Рисунок 6. Руками врача буквально лечится геном.
Рисунок 7. Развитие эмбриона из одного оплодотворенного яйца до бластоцисты.
Рисунок 8. Схема возможного использования органов свиней.
Рисунок 9. ГМ-пища.
Рисунок 10. Схематичное изображение «дизайнерского» ребенка.
Тем не менее случайные мутации, которые ненароком могут появиться при редактировании генома, потенциально могут быть еще опаснее, чем имеющиеся (рис. 11).
Рисунок 11. Схематичное изображение гена с опасной мутацией.
Этично ли редактировать людей?
CRISPR/Cas9 предстоит преодолеть не только технические трудности, которые требуют приближенного к ста процентам результата для внедрения в практическую медицину, но и этические (рис. 12). Насколько нравственно редактировать геном человека, данный ему при рождении? Можем ли мы вмешиваться в работу природы и модифицировать ее по своему усмотрению?
Рисунок 12. Обложка книги профессора Калифорнийского университета Пола Кнопфлера — GMO sapiens.
Международный мораторий на опыты над людьми говорит сам за себя. А проведенные на данный момент исследования имели четкие рамки, закрепленные законодательно. Вынашивание и рождение «редактированного ребенка» в таких условиях невозможно.
По мнению биоэтика из Университета Висконсина в Мэдисоне Альты Чаро, «дизайнерские дети» — сомнительная перспектива для CRISPR/Cas9. Исследовав положение дел с технологией генной модификации, она сделала заявление: «Озабоченность по поводу проведенных экспериментов раздута. Это увлекательный, важный и достаточно внушительный шаг к изучению правильного редактирования эмбрионов. Независимо от беспокойных предположений, это не начало эпохи „дизайнерских детей“. Наследование таких признаков, как интеллект или атлетизм, определено множеством генов. Разгадать каждый из них и спроектировать ребенка не представляется возможным» [19].
Что же принесет миру технология генного редактирования CRISPR/Cas9 — пользу или вред? Однозначного ответа на этот вопрос не даст никто. Хотя практической пользы от технологии пока получено не было, то будущее, которое рисует CRISPR/Cas9 в рамках биомедицины, рано или поздно наступит. И нам откроется возможность узреть и понять этот новый и смелый отредактированный мир (рис. 13).
Рисунок 13. Безграничные возможности CRISPR/Cas9.