Что такое праймеры в пцр
Интересно и полезно
Полезная информация для каждого
Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.
Полимеразную цепную реакцию используют для анализа индивидуальных вариаций последовательности нуклеотидов определенных локусов, для повышения эффективности клонирования целевых последовательностей изучаемых геномов и их прямого секвенирования, для детекции в организме патогенных микроорганизмов и т. п.
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Праймеры- короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Реакция проводится в 30-50 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий
Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.
Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии— 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).
Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.
Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) растет экспоненциально, а количество «длинных» копий ДНК линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент ДНК. Через некоторое количество циклов рост количества продуктов замедляется за счет ограничения количества реагентов, наличия ингибиторов, появления побочных продуктов реакции.
ПЦР реального времени (real-time PCR)
Real-time PCR это группа методик, дающие возможность качественного анализа продуктов ПЦР в режиме реального времени по ходу проведения реакции. Основными этапами данного метода являются:
Кинетическая кривая PCR в координатах «Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации» имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии:
Полимеразная цепная реакция, известная более как «ПЦР» не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии. Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.«Иглой» является крошечный фрагмент генетического материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естественное свойство ДНК- репликацию (размножение), делает его копии.
В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 100 млрд. идентичных молекул.Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах. Принцип этой реакции достаточно прост и теоретически для её исполнения нужны лишь пробирка, несколько реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте.
Анализ генетического материала особенно актуален для медицинской диагностики и ПЦР открывает для этого новые перспективы. ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда заболеваний «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически.
Что же может ПЦР? Основные медицинские области применения этого метода – диагностика инфекций и наследственных заболеваний.ПЦР открывает поистине фантастические возможности анализа генома человека – выявления дефектных генов, определяющих наследственную предрасположенность к заболеваниям.Вместе с тем, интересно и обнаружение генов, несущих информацию о полезных признаках.Например, генов снижающих риск опухолевого перерождения тканей или генов, значительно уменьшающих вероятность заражение ВИЧ-инфекцией.ПЦР используется также при генетической идентификации личности, определении степени родства.Только результат анализа ДНК позволяет окончательно дать заключение о достоверности отцовства.
Но, пожалуй, самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявлять этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, клещевого энцефалита, туберкулеза, заболеваний, передающихся половым путем и т.д. На сегодняшний день практически нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.
Всем известна длительность процедуры классических методов бактериологического выделения возбудителя туберкулеза: иногда подтверждение диагноза может занимать 5 –6 месяцев.Если использовать метод ПЦР, этот срок можно сократить до нескольких часов.Высокочувствительный анализ проведенный сразу после укуса клеща позволит ответить на вопрос произошло ли заражение вирусом клещевого энцефалита или боррелиозом – методы профилактики и лечения этих клещевых инфекций совершенно различны. Это лишь самые яркие примеры преимуществ данного анализа.
Важное значение метод имеет для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях.Определение “вирусной нагрузки”, т.е. количества вирусных частиц в крови позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов. При помощи ПЦР удается выявить отдельные субтипы и штаммы вирусов и бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к тем или иным лекарственным препаратам.
Говоря о несомненном прогрессивном значении метода ПЦР, его неоспоримых преимуществах, вместе с тем, следует знать и об определенных проблемах его проведения. Чрезвычайная чувствительность метода требует строго соблюдения специального технологического режима, тщательного выполнения всех этапов анализа в отдельных изолированных зонах лаборатории. Недостаточная внимательность к процедурным тонкостям влечет неизбежную контаминацию проб и появление ложноположительных результатов.
Широкое использование недостаточно отработанных тестов при диагностики урогенитальных заболеваний, к сожалению, часто приводит к неверному результату и необоснованному назначению дорогостоящей терапии, иногда оставляющей массу побочных эффектов. Таким образом, недобросовестное проведение анализа ведет к незаслуженной дискредитации метода.
Для правильной интерпретации результатов необходимо также знать, что выявление ДНК возбудителя не всегда говорит о состоянии его жизнеспособности, а также о непосредственной связи выявленного инфекционного агента с конкретным патологическим процессом.Результат ПЦР значительно увеличивает свою информативность при комплексном обследовании пациентов с дополнительным использованием других лабораторных (иммуноферментных, биохимических и др.) и клинических исследований.
Результаты научных исследований указывают на необходимость определения чувствительности перед назначением антимикробной терапии. Знание бактериальной резистентности к антибиотикам имеет важное значение для успешной борьбы с болезнью.
Назначение несвоевременной и неадекватной терапии внутрибольничных и тяжелых инфекций увеличивает вероятность летального исхода. Поэтому очень важно на ранних стадиях заражения выявить тип антибиотикорезистентности, чтобы подобрать адекватную схему лечения и использовать наиболее эффективные антибактериальные препараты. В случае тяжелых инфекций это нужно сделать в кратчайшие сроки.
В отличие от традиционных микробиологических методов, метод ПЦР позволяет проводить идентификацию генетических детерминант резистентности микроорганизмов, в том числе сложно культивируемых бактерий, в течение 4 часов. Он отличается высокой точностью и меньшими требованиями к забору материала, не требует наличия питательных сред, дисков с антибиотиками и дополнительных реактивов. Определение антибиотикорезитентности с помощью ПЦР позволяет спрогнозировать появление устойчивости к различным группам антимикробных препаратов, а также оценить распространение резистентных штаммов на локальном и региональном уровнях. Поэтому обнаружение антибиотикорезистентности методом ПЦР является отличным дополнением к традиционному микробиологическому тестированию.
В современной клинической практике можно выделить несколько вариантов антибактериальной резистентности, приводящих к крайне серьезным социально-экономическим последствиям. К таким вариантам относятся:
Большинство из перечисленных вариантов обусловлено приобретением бактериями данной группы той или иной генетической детерминанты устойчивости (таблица 1), обнаружение которой возможно с помощью ПЦР.
В ООО НПФ «Литех» разработана серия ПЦР-наборов для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.
Грамотрицательные бактерии, в том числе возбудители нозокомиальных инфекций, как правило, реализуют устойчивость к b-лактамным антибиотикам за счет продукции многочисленных β-лактамаз, при этом один штамм может продуцировать несколько различных ферментов. Продуцируемые бактериями ферменты различны по своей субстратной специфичности, среди них выделяют следующие типы:
Генотипирование на основе ПЦР остается золотым стандартом детекции и идентификации β-лактамаз, в том числе металло-β-лактамаз.
Необходимость обнаружения генов blaSHV, blaTEM, ответственных за продукцию пенициллаз, или b-лактамаз узкого спектра действия (NSBL)
Штаммы, продуцирующие β-лактамазы узкого спектра действия (NSBL), обычно вырабатывают TEM-1 и/или SHV-1 ферменты, которые разрушают пенициллины и ранние цефалоспорины, но чувствительны к другим классам β-лактамных антибиотиков. Мутации в промоторном участке гена TEM-1 могут привести к гиперпродукции этих ферментов. Подобная гиперпродукция может обернуться устойчивостью к другим b-лактамным антибиотикам, помимо пенициллина. Точечные мутации в этих ферментах могут привести к возникновению устойчивости к ингибиторам β-лактамаз, например, сульбактаму и клавулановой кислоте. Устойчивые штаммы особенно опасны при лечении инфекций у детей, когда препаратами выбора являются пенициллины и ранние цефалоспорины. При неадекватной терапии существует риск перехода заболевания в хроническую форму.
Для обнаружения генов устойчивости к пенициллинам и ранним цефалоспоринам разработаны следующие наборы:
• Резистентность к пенициллинам – 1
Резистентность Enterobacteriaceae и Pseudomonas к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Гены TEM)
Резистентность Enterobacteriaceae к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Ген SHV-не ESBL)
Для обнаружения устойчивости энтеробактерий к цефалоспоринам разработан набор:
Резистентность Enterobacteriaceae к цефалоспоринам. (Гены CTX-M)
Необходимость обнаружения генов, ответственных за продукцию металло-бета-лактамаз, или карбапенемаз
Карбапенемы, главным образом имипенем и меропенем, являются основными агентами в борьбе с грамотрицательными палочками, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. В этой связи распространение грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы, представляет серьезную проблему в сфере здравоохранения. С 2009 года Национальная референсная лаборатория Германии отслеживает молекулярную эпидемиологию карбапенемаз грамотрицательных нозокомиальных патогенов. В 2011 среди 1454 бактериальных изолятов устойчивость к карбапенемам была обнаружена у 34,4% штаммов Enterobacteriaceae, 19,9% штаммов Pseudomonas aeruginosa и в 96,3% изолятов Acinetobacter baumannii.
Распространение NDM-1 гена, кодирующего Нью-Дели металло-b-лактамазу (NDM-1) в Enterobacteriaceae, является одной из основных проблем глобального здравоохранения. Продукт гена NDM-1 способен гидролизовать практически все b-лактамные антибиотики и в сочетании с другими механизмами резистентности делает бактерию устойчивой почти ко всем антибиотикам. Первоначально плазмиды, кодирующие blaNDM-1, были обнаружены у Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli. Посредством конъюгации плазмиды могут передаваться и другим видам. Недавно blaNDM-1 были обнаружены в Acinetobacter baumannii и Vibrio cholerae.
NDM ферменты, такие как NDM-4, сейчас эволюционируют в более каталитически активные варианты.
Инфекции крови, вызванные OXA-48-продуцирующими Enterobacteriacea, имеют плохой прогноз, поскольку часто происходит задержка между постановкой диагноза и началом адекватной терапии.
Обнаружение способности продуцировать металло-β-лактамазы различными представителями грамотрицательных бактерий, оценка масштабов встречаемости кодируемых их генов в клинических образцах важны для предотвращения распространения инфекции и проведения адекватной этиологической терапии пациентов.
Задачу обнаружения генов, кодирующих карбапенемазы, решают следующие наборы:
Резистентность Enterobacteriaceae и Pseudomonas к карбапенемам. (Гены VIM)
Резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемам. (Гены NDM)
Резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемам. (Гены OXA-48)
Грамположительные бактерии, как правило, реализуют устойчивость к b-лактамным антибиотикам за счет модификации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), являющихся их мишенями действия. В частности, стафилококки способны синтезировать ПСБ2а, обладающий сниженной аффинностью к пенициллинам (метициллину и оксациллину) и цефалоспоринам. Способность к продукции такого белка кодируется геном MecA, передающимся в популяции в составе мобильной хромосомной кассеты.
• Резистентность к цефалоспоринам- 2
Резистентность S. aureus к b-лактамным антибиотикам. (Ген MecA)
Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium являются причиной 85-90% энтерококковых и третьей по частоте причиной внутрибольничных инфекций, особенно бактериемии, сепсиса у детей, эндокардита, инфекций мочевыводящих путей. Большинство больничных изолятов энтерококков устойчивы к обычным антибиотикам, устойчивость к ванкомицину достигает 40% популяции. Два гена резистентности (VanА и VanB) являются наиболее распространенными, особенно среди E. faecium. Штаммы с VanА геном устойчивы к ванкомицину и тейкопланину, штаммы с VanB устойчивы к ванкомицину, но сохраняют чувствительность к тейкопланину.
Ванкомицин-устойчивые энтерококки (VRE) являются важными этиологическими агентами внутрибольничных инфекций. Частота обнаружения VRE особенно высока в отделениях интенсивной терапии новорожденных в связи с иммунной недостаточностью у новорожденных, частым использованием антибиотиков и длительного срока госпитализации.
По данным последних публикаций метод ПЦР является наиболее быстрым и чувствительным методом для одновременного обнаружения энтерококков и определения их резистентности к ванкомицину. Среднее время проведения ПЦР и стандартного микробиологического исследования занимает 10 часов и 5 дней, соответственно.
Для выявления устойчивости энтерококков к гликопептидным антибиотикам разработан набор:
• Резистентность к гликопептидам
Резистентность E. faecalis и E. faecium к ванкоминицу и тейкопланину. (Фенотипы VanA и VanB).
Полимеразная цепная реакция – руководство для начинающих
ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.
Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.
Основные ингредиенты ПЦР:
Полимераза
Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие. Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus. Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC. Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.
Шаблон ДНК
Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК. Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.
Праймеры
Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.
Нуклеотиды
Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.
Буфер
Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.
Термоциклирование
Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют. При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом. Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:
На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.
На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.
На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК. Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров. Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.
На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´. Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции. Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования. Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.
Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз
Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.
Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации. Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.
Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи. Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения. Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.