что такое фосфатаза в молоке

ГК «Униконс»

Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.

«Антисептики Септоцил»

Септоцил. Бытовая химия, антисептики.

«Петритест»

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

«АльтерСтарт»

Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.

3.4. Влияние активности ферментов после технологической обработки сырого молока на изменение качества питьевого молока и молочных продуктов

Строгое соблюдение режимов пастеризации и стерилизации, низкие температуры хранения пастеризованного и стерилизованного молока являются необходимыми условиями для сохранения качества питьевого молока и молочных продуктов. Ухудшение качества питьевого молока в процессе хранения может быть обусловлено жизнедеятельностью бактерий (остаточное количество термостойкой микрофлоры и вторичное обсеменение), активностью ферментов в сыром молоке, а также остаточной и восстановленной активностью ферментов сырого молока после его тепловой обработки.

Таким образом, в целом ферментативная активность пастеризованного и стерилизованного молока (цельного, обезжиренного и сливок) является тестом для определения их качества и стойкости при хранении.

Типичные психрофильные бактерии рода Pseudomonas и другие грамотрицательные палочки не выдерживают температур пастеризации. Поэтому присутствие их в пастеризованном молоке свидетельствует либо о нарушении температурного режима пастеризации, либо повторном обсеменении молока при розливе.

Рис. 49. Изменение общей бактериальной обсемененности (1 – общее количество бактерий; 2 – бактерии группы кишечной палочки) пастеризованного молока (Королева Н. С):

а – на отдельных этапах технологического процесса его производства (С – сырое молоко; П – пастеризованное; Б – молоко из упаковки; X – после хранения в течение 2 сут при 8°С);

б – в зависимости от кратности заполнения резервуара

Вторичное бактериальное обсеменение молока (сливок) после пастеризации играет существенную роль в повышении его ферментативной активности (рис. 49, а). В основном бактериальное обсеменение молока после пастеризации происходит при розливе, в трубопроводах и в резервуарах для хранения молока, если их заполнение чередуется с периодами, когда они остаются незаполненными и невымытыми. При каждом последующем заполнении резервуара происходит резкое повышение общей микробной обсемененности молока, а следовательно, повышение активности ряда ферментов молока микробного происхождения, обусловливающих изменение и ухудшение его качественных показателей (рис. 49, б).

Основную роль в повышении кислотности пастеризованного молока при хранении играют холодостойкие штаммы L. lactis, а именно их лактатдегидрогеназная и β-галактозидазная активности (гл. 1). Проявление активности экзолипаз- и протеаз-термостойких психрофильных бактерий в пастеризованном молоке вызывает изменение жира и белка, приводящее к появлению пороков запаха и вкуса (Моисеева Е. Л., 1988).

Вторичное микробное обсеменение пастеризованного молока (сливок) и в результате нарушения условий его хранения на молочных предприятиях до реализации обусловливает значительное накопление оксидоредуктаз, в результате активности которых молоко приобретает различные пороки вкуса и запаха. Поэтому в производстве важным является не только контроль активности этих ферментов в сыром молоке, но и в молоке пастеризованном. Это тем более важно, если в дальнейшем его используют для выработки продуктов, подлежащих концентрации и длительному хранению.

Показано, что метод определения активности редуктаз (дегидрогеназ) с использованием резазурина применим не только для оценки санитарно-гигиенического качества сырого молока, но и для прогноза стойкости пастеризованного молока при хранении (табл. 67). Только молоко, которое сразу после розлива при проведении редуктазной пробы с резазурином приобретает серо-стальную окраску, в течение последующих двух суток хранения при температуре не выше 8 °С отвечает требованиям ГОСТ Р 52090 «Молоко питьевое». На основании полученных данных разработана шкала прогноза стойкости пастеризованного молока (Н. С. Королева и др.).

Вторичное бактериальное обсеменение молочнокислыми бактериями, обладающими выраженной лактатдегидрогеназной активностью, при хранении пастеризованного молока обуславливают повышение содержания в нем пирувата. Так, при хранении пастеризованного молока в течение 7 сут при ≈ 7 °С содержание пирувата повышалось с 3,0 (в первые сутки) до ≈ 5,0 мг/л при одновременном ухудшении органолептических свойств молока, что подтверждается высокой корреляцией между содержанием пирувата и органолептическим скором пастеризованного молока – коэффициент корреляции составляет 0,81 (Suchren G., 1984).

В качестве критерия для оценки стойкости пастеризованного молока при хранении служит и активность оксидаз. Вследствие высокой термостойкости ксантиноксидазы, сульфгидрилоксидазы и цитохром с-оксидаз их активность в молоке, подвергнутом тепловой обработке, и продуктах, выработанных из него, может сохраниться на достаточно высоком уровне, что может быть одной из причин появления окисленного вкуса и запаха при их дальнейшем хранении. Ниже приведены данные по величинам активности ксантиноксидазы в цельном и обезжиренном питьевом и сухом молоке (Zikakis J.P., Wooters S.C., 1980).

Активность ксантиноксидазы, мкл О₂/мл/ч

Неблагополучным считают пастеризованное молоко, если оксидазоположительные микроорганизмы в нем составляют более 22 % общего количества микроорганизмов.

Рис. 50. Изменение активности оксидаз пастеризованного молока при его хранении в резервуаре до розлива:

1 – 0. 6 ч при 2. 4°С; 2 – 7. 9 ч при 2. 4°С; 3 – 0. 6 ч при 6. 8°С; 4 – 7. 9 ч при 6. 8 °С (активность оксидаз выражена через продолжительность (в мин) восстановления 1%-ного раствора N,N,N’,N’-тетраметил-n-фенилендиамин дигидрохлорида)

Результаты исследований изменения активности оксидаз при хранении пастеризованного молока показывают, что вследствие вторичного микробного обсеменения молока при розливе в процессе его хранения в течение 3 сут при 2. 4°С и 1 сут при 6. 8°С активность оксидаз повышалась в 1,5. 2,0 раза, а к концу вторых суток хранения при 6. 8°С – соответственно в 2 и 2,5 раза по сравнению с контролем (рис. 50). В процессе хранения молока при 10. 12° С отмечалось значительное повышение активности оксидаз уже к концу первых суток. При этом изменение оксидазной активности молока сопровождалось снижением его органолептических показателей, титруемой кислотности, термостойкости и редуктазной активности. Обнаружено, что если активность оксидаз в пастеризованном молоке сразу после розлива составляла 5 мин или менее, то такое молоко соответствовало требованиям ГОСТ Р 52090 в течение 3 сут при 2. 3 °С или в течение 2 сут при 6. 8 °С. Таким образом, оксидазная активность пастеризованного молока является достаточно объективным тестом определения его стойкости при хранении. Разработана шкала тестирования свежести пастеризованного молока по его оксидазной активности (Шидловская В. П., 1997):

Как было отмечено выше, каталаза при общепринятых режимах пастеризации молока только в некоторой степени сохраняет свою активность. Поэтому если долго хранившееся пастеризованное молоко показывает положительную реакцию на каталазу, то в этом случае она является в основном продуктом жизнедеятельности микроорганизмов, попавших в молоко после его пастеризации. Показано, что остаточная активность каталазы в пастеризованном молоке может составить 5. 10% О₂. Повышение активности каталазы при хранении пастеризованного молока до 25 % О₂ свидетельствует уже о значительном обсеменении такого молока микроорганизмами.

Установлена высокая корреляция (r = 0,89) между активностью каталазы и общим содержанием аэробной мезофильной микрофлорой при хранении цельного пастеризованного молока (75 °С, 20 с) при 4 °С в течение 14 сут (рис. 51).

Поэтому контроль активности каталазы при хранении пастеризованного молока является объективным тестом для определения степени обсеменения молока микроорганизмами (особенно гнилостными), а также его стойкости при хранении.

Следует отметить, что даже остаточная активность сульфгидрилоксидазы в пастеризованном молоке играет определенную роль в улучшении его вкуса (за счет окисления сульфгидрильных групп). Очевидно, что если сульфгидрилоксидаза станет доступной в промышленном масштабе, а также если она будет иммобилизована удовлетворительным образом, она должна иметь хорошие перспективы применения для молока УВТ-обработки. Однако для успешного применения ее в промышленности необходим существенный микробный источник сульфгидрилоксидазы.

Рис. 51. Соотношение между активностью каталазы и общим содержанием мезофильной аэробной микрофлоры в пастеризованном молоке в хранении при 4 °С в течение 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14 сут (соответствует 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 классам) (Kang D. Н., Dougherty R. Н. et al., 2002):

1 класс – log КОЕ/мл 2 и 3 и 4 и 5 и 6 и 7 и 8 и 1) выдержка 10 с.

Накопленные в сливках в результате ферментативного гидролиза молочного жира СЖК катализируют окисление жира и тормозят действие естественных антиокислителей, способствуя развитию в сливках окисленного вкуса. Поэтому масло, выработанное из «липолизованных» сливок, более подвергается окислению, чем масло, выработанное из доброкачественных сливок. Выявлена достаточно высокая корреляционная зависимость между липолитической активностью сливок и кислотностью масла, выработанного из них (+0,897. +0,922 для различных сортов масла) (Mortensen В. К., Jansen К.).

Радом исследователей установлено, что быстрая порча масла является результатом повышенного липолиза молока, обусловленного зоотехническими факторами, условиями получения и первичной обработки молока. При производстве сливочного масла осенью и в начале зимы особенно важно учитывать липолитическую активность исходных молока или сливок, что обусловлено заметным повышением активности липаз в молоке в связи с окончанием лактации (гл. 2 п. 2.1).

При сушке молока (или сливок) с выраженными липолизированным (прогорклым) вкусом или запахом сухое молоко или сухие сливки приобретают этот порок в результате концентрирования накопленных СЖК при липолизе исходного сырья.

Данные, приведенные в табл. 69, показывают, что проявление остаточной активности бактериальных липаз в молоке после УВТ-обработки тесно связано со снижением его органолептических показателей в процессе хранения (Mottar T., 1981). Коэффициент корреляции между органолептической оценкой молока и его липолитической активностью составил при этом 0,63. Более тесная корреляция отмечается в случае прямого способа нагрева молока. Следовательно, косвенный способ УВТ-обработки молока в части инактивации термостойких липаз более эффективный, чем прямой. Отсюда контроль степени липолиза в молоке (и сливках) является одним из важных путей борьбы с прогорклым вкусом молока и сливок, а также продуктов, приготовленных из них.

Необходимо отметить, что значительное сохранение активности кислой фосфатазы в молоке после его тепловой обработки может вызвать нежелательные изменения казеина при хранении молока (и молочных продуктов), так как потеря кислого фосфата в результате дефосфорилирования казеина кислой фосфатазой повышается pH его изоэлектрической точки с 4,6. 4,7 до pH 5,0. 5,2, что может привести к более ранней потери его стабильности (Kitchen В. J., 1985; Balci А. Т., Wilbey R. А., 1999).

В гл. 3 отмечено, что термостойкость протеолитических ферментов молока, как нативных, так и микробного происхождений, довольно высокая. Поэтому остаточная активность этих ферментов, а также протеаз, в результате вторичного микробного обсеменения пастеризованного молока, может быть причиной гидролиза белков молока при его хранении. Результаты исследований показывают, что содержание протеозо-пептонной фракции в процессе хранения пастеризованного молока в течение 1 и 2 сут при 2. 4 и 6. 8° С повышалось, по сравнению с исходным содержанием, соответственно на 16,2, 20,2 и 23,7, 26,1 % (Шидловская В. П., Рашкина Н. А.).

Даже при непродолжительном хранении пастеризованного молока при 37 °С отмечается переход неактивной формы нативной протеиназы молока (плазминоген) в активную (плазмин). Повышение протеолитической активности при хранении пастеризованного молока происходит быстрее, чем при сырого молока, поскольку при тепловой обработке инактивируется ингибитор активатора плазминогена (Kitchen В. J., 1985).

При хранении пастеризованного молока, разлитого в асептических условиях, при температуре ниже 5°С, изменения запаха и вкуса, связанные с микробными липолизом и протеолизом, обычно развиваются через 7 сут. Ухудшение запаха и вкуса и гелеобразование молока УВТ-обработки в результате липолиза и протеолиза не только связано с проявлением активности остаточных бактериальных липаз и протеиназ, но и с нативной щелочной протеиназой. Молоко после косвенного способа нагрева хранится дольше, чем после прямого (Hayes М. G., McSweeney P. L. Н., Kelly A. L., 2002).

Активность термостойких протеиназ, как нативных, так и микробного происхождения, является важным фактором в деле сохранения качества стерилизованного молока, полученного способом УВТ-обработки, в условиях длительного хранения при температуре окружающей среды.

Развитие протеолиза при хранении стерилизованного молока связывают с появлением в нем горького вкуса.

Коэффициент корреляции между выраженностью горького вкуса и степенью протеолиза при хранении молока УВТ-обработки в течение 10 недель при 20 °С составил в среднем 0,81. Такая зависимость установлена как при прямом, так и при косвенном способах нагрева – степень протеолиза за указанный период хранения составила в среднем 0,376 и 0,190 мкмоль свободных аминогрупп/мл соответственно.

Гидролиз белков при хранении стерилизованного молока (140 °С, 2. 4 с, прямой способ нагрева) подтверждается заметным изменением содержания в нем различных азотистых веществ (табл. 70) (Селезнев В. И., Домбровская Е. И. и др.). Заметную роль в протеолитической активности стерилизованного молока отводят термостойким протеиназам Pseudomonas.

1) Содержание небелковых азотистых веществ приведено в мгN%.

Обнаружено, что при хранении цельного и обезжиренного УВТ-обработанного молока (147°С с выдержкой 2 с – прямой способ нагрева и 149 °С с выдержкой 23 с – косвенный способ нагрева) в течение 11 недель при 22 °С активности нативной и бактериальных протеиназ были более выражены в обезжиренном молоке, обусловливающие большую степень протеолиза в обоих способах нагрева (Lópéz-Fandino R., Olano A. et al., 1993).

Установлено, что выдержка при стерилизации молока в большей степени, чем температура стерилизации, влияет на продолжительность хранения стерилизованного молока. Так, стерилизация при 140°С в течение 16 с оказалась достаточной для получения стерилизованного молока, хорошо сохраняющего свое качество в течение 12 недель при 20 °С, по сравнению с обработкой в течение 4,8 с и при той же температуре, когда влияние стерилизации на протеазы было незначительным (Driessen F. М., Walls С. В., 1978).

В табл. 71 приведены данные по влиянию остаточной активности протеолитических ферментов на органолептическую оценку молока после УВТ-обработки. Коэффициент корреляции между органолептической оценкой молока после УВТ-обработки и активностью в нем протеолитических ферментов составил в среднем 0,65. Более тесная корреляция была в случае прямого способа нагрева, чем косвенного. Таким образом, косвенный способ УВТ-обработки молока в части инактивации термостойких протеаз, как и липаз, более надежный, чем прямой способы нагрева (Mottar T., 1981).

1) НБА – небелковый азот.

Высокая протеолитическая активность молока после УВТ-обработки связана не только с возникновением горького вкуса при длительном хранении, но и с его загустеванием (образованием геля). Так, в молоке, полученном в асептических условиях, в дальнейшем обезжиренного и подвергнутого УВТ-обработке путем прямой инжекции паром при 142 °С и выдержке 4 с, образование геля обнаружено через 90 дней его хранения при 20 °С.

Рис. 52. Изменение содержания различных фракций казеина при хранении молока после УВТ-обработки (Snoeren T.H., Spek C.A. et al., 1979):

На рис. 52 представлены данные, характеризующие относительную степень гидролиза различных фракций казеина в таком молоке. Большему гидролизу подвергался β- и α_s2-казеин. Гелеобразование при хранении УВТ-обработанного молока связывают и с остаточной активностью нативной протеиназы молока – плазмином (по Hayes М., McSweeney R. L. Н., Kelly A. L., 2002).

Гелеобразование при хранении стерилизованного молока может быть результатом не только остаточных активностей термостойких протеиназ как нативного, так и бактериального происхождения, но и возможной реактивации этих ферментов. Причина гелеобразования может заключаться и в том, что при гидролизе β-казеин теряет 4/5 фосфатных остатков и гидрофильную часть пептидной цепи, вследствие чего мицеллы казеина становятся неустойчивыми и начинают коагулировать (Reimendes Е. Н., Klostermeyer Н., Sayk Е.).

Считают, что наряду с ферментативным процессом гелеобразования молока после УВТ-обработки при длительном хранении имеет место и (или) только чисто физико-химический процесс гелеобразования. Так, важными факторами, влияющими на потерю стабильности стерилизованного молока, являются образование комплекса β-лактоглобулина с казеином и изменение молекулярной структуры мицелл казеина в результате сильного теплового воздействия на молоко. Причиной гелеобразования может быть и реакция Майара, которая стимулирует полимеризацию казеина. Для протеолиза важным является также наличие в молоке термолабильного ингибитора протеиназ. Вместе с тем, ферментативный процесс гелеобразования считают основным. Какие ферменты будут преобладать в процессе гелеобразования, будет зависеть от количества и вида бактериального обсеменения молока перед его тепловой обработкой, концентрации и активности в молоке нативных протеиназ. Структура образующегося геля при длительном хранении стерилизованного молока будет зависеть от преобладания тех или иных протеиназ. Нативные протеиназы образуют гель, который не имеет типичной структуры, в то время как бактериальные протеиназы образуют гель, напоминающий сычужный сгусток (Humbert G., Alais Ch., 1979; Shmidt D. G., 1980).

В табл. 72 приведены данные по зависимости между степенью протеолиза и образованием осадка при хранении УВТ-обработанного молока (Шидловская В. П., 2004).

Отмечают, что при прямом способе УВТ-обработки молока гелеобразование наступает раньше, чем при косвенном способе нагрева.

Считают, что продолжительность периода до наступления гелеобразования заметно увеличивается при добавлении к молоку полифосфатов, препятствующих агрегации мицелл казеина (Fox R. F., 1981).

1) Осадок получен путем центрифугирования молока при 2000 об/мин в течение 10 мин и дальнейшей сушки при 100°С.

Таким образом, гликолитические, липолитические и протеолитические ферменты вызывают заметные изменения качества питьевого молока и молочных продуктов при хранении. Для уменьшения этой ферментативной активности необходимо снижать возможность всякого рода повторного бактериального обсеменения молока и хранить продукцию при 4. 6°С. При хранении необходимо контролировать липолитическую и протеолитическую активности молока, как и перед его тепловой обработкой. В случае высокой активности необходимо усиливать режимы тепловой обработки молока. Это позволит прогнозировать продолжительность хранения питьевого молока и молочных продуктов после высокотемпературной пастеризации, УВТ-обработки в условиях неконтролируемых температур.

Источник

ПРОБА НА ФОСФАТАЗУ

про́ба на фосфата́зу, метод определения эффективности пастеризации молока. К 2 мл молока добавляют 1 мл 0,1%-ного раствора фенол фталеинфосфата натрия в аммиачной буферной смеси (80 мл 1 н. раствора аммиака и 20 мл 1 н. раствора хлорида аммония), нагревают на водяной бане (40—45°C) и проверяют окраску содержимого пробирки через 10 и 60 мин. Если фосфатаза разрушена, то есть молоко пастеризовано, его цвет не изменяется. Светло- или ярко-розовое окрашивание свидетельствует о нарушении режима пастеризации.

Смотреть что такое «ПРОБА НА ФОСФАТАЗУ» в других словарях:

Молоко — В этой статье не хватает ссылок на источники информации. Информация должна быть проверяема, иначе она может быть поставлена под сомнение и удалена. Вы можете … Википедия

Нормализация молока — Стакан коровьего молока Молоко питательная жидкость, вырабатываемая молочными железами самок млекопитающих. Естественное предназначение молока вскармливание детёнышей, которые ещё не способны переваривать другую пищу. В настоящее время молоко… … Википедия

Коровье молоко — Стакан коровьего молока Молоко питательная жидкость, вырабатываемая молочными железами самок млекопитающих. Естественное предназначение молока вскармливание детёнышей, которые ещё не способны переваривать другую пищу. В настоящее время молоко… … Википедия

Цельное молоко — Стакан коровьего молока Молоко питательная жидкость, вырабатываемая молочными железами самок млекопитающих. Естественное предназначение молока вскармливание детёнышей, которые ещё не способны переваривать другую пищу. В настоящее время молоко… … Википедия

Пастеризация молока — 6) пастеризация процесс термической обработки сырого молока или продуктов его переработки. Пастеризация осуществляется при различных режимах (температура, время) при температуре от 63 до 120 градусов Цельсия с выдержкой, обеспечивающей снижение… … Официальная терминология

Пимекролимус — (Pimecrolimus) … Википедия

Источник

Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов

Стандарт устанавливает флуориметрический метод для определения активности щелочной фосфатазы (ALP) в пастеризованном цельном, полужирном и обезжиренном молоке. Метод применим для молока коров, овец, коз и для молочных напитков. Метод также пригоден для определения высокой активности щелочной фосфатазы в сыром и термообработанном молоке с активностью более 2000 мЕ/л после заданного разбавления образца.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО
ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ
СТАНДАРТ
российской
ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Определение активности щелочной фосфатазы

Флуориметрический метод для молока и молочныхпродуктов

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийскийнаучно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») на основеаутентичного перевода международного стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническимкомитетом стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции набезопасность»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕНВ ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию иметрологии от 6 ноября 2008 г. № 289-ст

При этом дополнительные слова,фразы, абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальнойэкономики Российской Федерации и особенностей российской национальнойстандартизации, выделены курсивом

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТРОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Определение активности щелочной фосфатазы

Часть 1

Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов

Milk and milk products. Determination of alkaline phosphatase activity. Part 1. Fluorimetric method for milk and milk products

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает флуориметрический метод дляопределения активности щелочной фосфатазы ( ALP ) в пастеризованном цельном, полужирном и обезжиренноммолоке. Метод применим для молока коров, овец, коз и для молочных напитков.

Метод также пригоден дляопределения высокой активности щелочной фосфатазы в сыром и термообработанноммолоке с активностью более 2000 мЕ/л после заданного разбавления образца.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки наследующие стандарты:

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины ссоответствующими определениями:

3.1 активностьщелочной фосфатазы ( ALP активность): Активностьщелочной фосфатазы, присутствующей в продукте, определенная методом,установленным настоящим стандартом.

3.2 единицаактивности щелочной фосфатазы: Объем фермента щелочной фосфатазы, который катализируетпревращение 1 мкмоль субстрата в минуту.

4 Сущность метода

Активность щелочной фосфатазы дляобразца измеряется путем непрерывного флуориметрического прямого кинетическогоанализа. В субстрате нефлуоресцентного ароматического монофосфорного эфира,2′-[2-бензотиазолил]-6′-гидроксибензотиазол фосфат, в присутствии любойщелочной фосфатазы, образованной из этого образца, происходит гидролиз егофосфатного радикала, производя продукт с интенсивной флуоресценцией.Флуориметрическое измерение активности щелочной фосфатазы проводят притемпературе 38 °С в течение трех минут, используя субстрат. Сюда включенапреинкубация субстрата и образца с последующим многократным кинетическимсчитыванием скорости реакции.

5 Реактивы

Используются только реактивы признаннойаналитической чистоты, если нет других указаний, и дистиллированная илидеминерализованная вода или вода аналогичной чистоты.

5.1 СубстратФлуорофоса® в пробирках, каждая из которых содержит 144 мг порошка Флуорофоса®.

Этот субстрат нефлуоресцентногоароматического монофосфорного эфира,2′-[2-бензотиазо-лил]-6′-гидроксибензотиазол фосфат (Флуорофос®). СубстратФлуорофоса® остается стабильным в течение двух лет, если его хранить в закрытыхпробирках при температуре от 2 °С до 8 °С.

Буферный раствор субстратаостается стабильным в течение двух лет, если его хранить в закрытых пробиркахпри температуре от 2 °С до 8 °С.

5.3 Рабочий субстрат

Оставляют субстрат Флуорофоса® ибуферный раствор субстрата до достижения комнатной температуры. Добавляютсодержимое одной пробирки с буферным раствором субстрата (240 см 3 )к содержимому одной пробирки Флуорофоса® (144 мг) (см. 5.1) и хорошоперемешивают, переворачивая, в течение 3 мин. Используют желтое стекло длязащиты против света.

Перед использованием полученныйраствор выдерживают при комнатной температуре как минимум 30 мин.

Используют аналого-цифровой тест,описанный в 9.4.1.1, для проверки устойчивости готового к использованиюсубстрата.

Рабочий субстрат остаетсястабильным в течение 60 дней, если он защищен от света и хранится притемпературе от 2 °С до 8 °С, или в течение 8 ч, если хранится при 38 °С. Неследует использовать рабочий субстрат, если получено показание выше 1200.

Рабочие калибровочные растворыостаются стабильными в течение 18 мес, когда их хранят при температуре от 2 °Сдо 8 °С.

5.4.1Калибровочный раствор А, содержащий 0 мкмоль/дм 3 Флуорожелтого®.

6 Аппаратура

6.1 Фильтрованныйфлуориметр с термостатически регулируемым держателем кюветы при поддержаниитемпературы (38 ± 1) °С и правоугольной оптической системой, допускающейвозбуждение при длине волны 440 нм и испускание при 520-560 нм (например,прибор Флуорофос®).

Измерения должны бытьоптимизированы согласно инструкциям изготовителей.

6.2 Кюветы сменные,из нефлуоресцентного стекла, диаметром 12 мм и длиной 75 мм.

6.4 Инкубаторныйблок, поддерживающий температуру (38 ± 1) °С, подходящий для помещения в нихкювет.

6.5 Парафильм 1 )или другая подходящая пленка лабораторного класса.

6.7 Водяная баня,поддерживающая температуру (63 ± 1) °С и (95 ± 1) °С.

1) Парафильм является примером подходящего продукта,выпускаемого в промышленности.

7 Отбор проб

В лабораторию должна быть отправленапредставительная проба. Ее следует оберегать от повреждений во времятранспортирования или хранения.

рекомендуется Отбор пробпроводить по ГОСТ26809 и [1].

8 Подготовка к испытанию

8.1 Молоко, несодержащее щелочной фосфатазы

Приготовляют молоко без фосфатазыдля испытания, тщательно дозируя требуемую порцию молока в пробирку илиподходящий контейнер, следя, чтобы оно не касалось краев или стенок контейнера.

Помещают пробирку или контейнер собразцом молока в водяную баню, установленную на 95 °С, нагревают до 95 °С ипродолжают его подогрев в течение 5 мин при этой температуре. Температуруконтролируют термометром или термисторным зондом, помещенным в центр пробиркиили контейнера. Затем образец быстро охлаждают.

Таким образом обработанный образецмолока тестируют, чтобы удостовериться, что активность щелочной фосфатазыменьше 10 мЕ/л.

8.2 Приготовлениеобразца для испытаний

Перед использованием всеиспытуемые образцы тщательно перемешивают, не нагревая.

8.2.2Пастеризованные испытуемые образцы

Пастеризованные испытуемыеобразцы используют в состоянии после поставки в требуемых количествах.

8.2.3Разбавление испытуемых образцов с высокими значениями ALP

Приготовляют разбавленные образцымолока, используя молоко без фосфатазы, для того чтобы их уровни активностищелочной фосфатазы ALP соответствовали аналитическому диапазону испытания(

9 Проведение испытаний

9.1 Проверка рабочих характеристикприбора

Важно, чтобы до проведенияиспытания образцов была проведена проверка рабочих характеристик прибора наотклонение, рассеянное световое излучение и стабильность. Все параметрыфильтрованного флуориметра должны соответствовать требованиям 6.1.

Контрольные тесты качествавключают:

— ежедневный тест A / D (аналого-цифровоепреобразование), выполняемый для проверки правильности функционированияоборудования путем измерения точности канала A / D преобразования имониторинга A / D канала наотклонение по времени или температуре;

— ежедневныйконтрольный тест прибора с использованием ежедневного контрольного раствора вприборе для мониторинга любого электронного или оптического отклоненияфлуориметра.

Использование контрольных провероксистемы и реактивов, описанных в 9.4,настоятельно рекомендуется для ежедневного мониторинга параметров точностиприбора.

Калибровочные кривые обычностабильны. Прибор следует калибровать каждые три месяца. Однако в случае, когдафлуориметр устанавливают впервые или если процедуры обслуживания влияют насохраненную калибровку, или если проверенные контрольные значения показываютнеприемлемые результаты, то его калибруют повторно.

Если обнаружены измененияв калибровочной кривой, прибор также калибруют повторно, используя новый наборкалибровочных растворов А, В и С (см. 5.4).Калибровочную кривую устанавливают для каждого типа испытуемого продукта.

Перед использованиемкалибровочные растворы А, В и С смешивают, плавно переворачивая. С помощьюпипетки переносят по 2,0 см 3 калибровочных растворов А, В и Ссоответственно, каждого в двух экземплярах, в шесть предварительномаркированных кювет. Помещают кюветы в инкубаторный блок, установленный на 38°С, и предварительно нагревают в течение 10 мин.

С помощью нагнетательной или вытеснительнойпипетки добавляют 0,075 см 3 молока, не содержащего щелочнойфосфатазы, в шесть кювет. Закрывают кюветы парафильмом (см. 6.5).Перемешивают их содержимое с помощью вихревой мешалки в течение 5 с или путеммягкого переворачивания кювет. Возвращают кюветы в инкубационный блок.Выполняют калибровку в течение 10 мин после добавления испытуемого образца вкалибровочный раствор.

Начиная с калибровочного раствораА, выполняют следующие установившиеся процедуры калибровки. Перед помещениемкювет в фильтровальный Флуорофос® нажимают « CALIB » и выбирают меню « ALP Diary » (щелочная фосфатаза в молочных продуктах). Прокручивают меню и, когдаотображается продукт, который должен калиброваться, нажимают « ENTER ». Начиная с калибровочного раствора А помещаютэтот раствор во флуориметр и нажимают « START ». Когда измерение закончено, измеряют второйкалибровочный раствор А.

Такую же процедуру выполняют длякалибровочных растворов В и С, пока все процедуры не будут закончены. ПриборФлуорофос® автоматически вычисляет значение флуоресценции, полученное скалибровочными растворами В и С в сравнении с калибровочным раствором А, чтобыустановить калибровочный коэффициент прибора.

Когда калибровка выполнена,приступают к анализу испытуемых образцов.

С помощью дозатора фиксированногообъема переносят 2,0 см 3 субстрата в маркированную кювету. Помещаюткювету в инкубаторный блок, установленный на 38 °С, и нагревают в течение 15мин.

С помощью пипетки добавляют 0,075см 3 хорошо перемешанного испытуемого образца (см. 8.2.2 или 8.2.3)к субстрату. Накрывают кювету парафильмом (см. 6.5).Сразу же перемешивают ее содержимое, используя вихревую мешалку (см. 6.6) в течение 5 с или плавнопереворачивая кювету. Вытирают кювету снаружи мягкой тканью и помещают ее вфильтровальный флуориметр.

Нажимают клавишу « TEST », появляется надпись « ALP Diary », затем нажимают « ENTER ». Прокручивают меню и нажимают « ENTER », когда отображается продукт, который долженанализироваться. Затем нажимают клавишу « START », чтобы начать испытание. На дисплее будет идтиобратный отсчет 60 с, пока субстрат и образец нагреется до 38 ° С. Через 60 с флуориметр начинает измерение,показывая флуоресценцию образца в единицах флуоресценции ( FLU ). Отображение начинается с 200 FLU и медленновозрастает в течение следующих двух минут. В конце третьей минуты периода приборФлуорофос автоматически выполняет необходимые вычисления и отображаетидентификационный номер образца, активность ALP вмиллиединицах на литр и среднее увеличение флуоресценции, если это былопредварительно задано. Затем эта информация будет напечатана.

Делят разность между двумяпоказаниями флуоресценции на время интервала (записанное в минутах), чтобыполучить среднее увеличение флуоресценции в минуту ( F /мин). Используют значение F /мин, чтобы вычислить активность ALP дляиспытуемого образца.

Для очень низких результатов(обычно 6 FLU /мин), когданестабильные показания получаются чаще, оставляют кювету с образцом в камереФлуорофос® и проводят другое определение. Тогда обычно получаетсядействительный результат. Однако, если снова возникает ошибка из-занестабильных показаний, повторяют все определение с новым испытуемым образцом.

9.4.1 Контрольные проверкисистемы и реагентов

При использовании прибораФлуорофос тест A / D проводятежедневно перед испытанием.

Отмеряют 2,0 см 3 ежедневногоконтрольного раствора для прибора в маркированную кювету. Помещают кювету винкубаторный блок, установленный на 38 °С, на 10 мин.

Вставляют предварительно нагретуюкювету в держатель кюветы. Закрывают крышкой. Когда показание дисплеястабильно, записывают отображаемое значение, которое должно быть 602 ± 12. Еслизначение вне этого диапазона, используют маленькую отвертку из поставки имедленно поворачивают винт потенциометра с левой стороны прибора по часовойстрелке или против, как необходимо, пока показание дисплея не будет 602.

9.4.2 Испытуемый образеци механизмы контроля, связанные с прибором

9.4.2.1 Тестнегативного контроля

Включают тест негативногоконтроля с каждой партией испытуемых образцов. Нагревают испытуемый образец,как описано в 8.1. Показание приборадолжно быть меньше 10 мЕ/л, то есть флуоресцентная активность не детектируется.Если значение превышает 10 мЕ/л, повторяют действие 9.4.1.2.

9.4.2.2 Тестпозитивного контроля

Включают один или большемеханизмов позитивного контроля с каждой партией испытуемых образцов.Приготовляют образцы аналогичного или почти аналогичного состава, используяобразцы сырого молока, разбавленные молоком без фосфатазы.

9.4.3 Тест наинтерферирующие вещества

Если значения ALP получены вышеожидаемых, добавляют в кювету с помощью пипетки 0,075 см 3 испытуемогообразца и 2,0 см 3 калибровочного раствора А, которыйпредварительно нагревали в инкубаторном блоке, установленном на 39 °С, втечение 10 мин, и перемешивают.

Помещают кювету с этой смесью вприбор Флуорофос® и испытывают, как в 9.2. Если полученное значение превышает 20мЕ/л, значит, присутствует интерферирующее вещество. В этом случае повторяютиспытание со свежим образцом.

9.4.4 Контрольныйтест на теплостойкую щелочную фосфатазу

Добавляют другой испытуемыйобразец в пробирку. Вставляют термометр или термисторный зонд в пробирку и всепомещают в водяную баню, установленную на 63 °С. Когда испытуемый образецнагревают до 63 °С, его выдерживают при этой температуре 30 мин, затем быстроохлаждают. Определяют остаточную активность фосфатазы согласно 9.3. Любая остаточная активность обусловленаприсутствием теплостойкой микробной щелочной фосфатазы.

10 Вычисление и выражение результатов

10.1 Калибровочный коэффициент

Результаты вычисляютавтоматически прибором Флуорофос® посредством алгоритма, встроенного вфильтровальный флуориметр. Если результаты будут вычисляться вручную, действуютследующим образом.

Записывают значения флуоресценциикалибровочных растворов В и калибровочного раствора С (см. 5.4.3),сравнивают с калибровочным раствором А (см. 5.4.1),установленным на нулевую флуоресценцию на фильтровальном флуориметре.

Калибровочныйкоэффициент K вычисляют по формуле

Активность щелочнойфосфатазы А_р, мЕ/л, вычисляют по формуле

10.3 Выражение результатовиспытания

Результаты испытания выражают с точностью доближайшего целого знака миллиединицы.

11 Прецизионность

11.1 Межлабораторное испытание

Детали межлабораторного испытанияприведены в приложении А. Значения, полученные изэтого испытания, можно применять для других диапазонов и матриц.

Абсолютная разность между двумянезависимыми результатами единичных испытаний, полученными одним и тем жеметодом на идентичном испытуемом материале в одной и той же лаборатории одним итем же оператором, использующим одно и то же оборудование, в течение короткогоинтервала времени, должна не более чем в 5 % случаев превышать значения для г,приведенные в таблице 1.

Уровень активности щелочной фосфатазы, мЕ/л

Источник

• ← как понять какой у тебя цвет глаз если он непонятен
• что такое френч терри →