что такое рнк интерференция

РНК-интерференция

Из Википедии — свободной энциклопедии

РНК-интерференция (англ. RNA interference, RNAi ) — процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК.

Процессы РНК-интерференции обнаружены в клетках многих эукариот: у животных, растений и грибов. Система РНК-интерференции играет важную роль в защите клеток от вирусов, паразитирующих генов (транспозонов), а также в регуляции развития, дифференцировки и экспрессии генов организма.

Процесс РНК-интерференции начинается с действия фермента Dicer, который разрезает длинные молекулы двуцепочечной РНК (dsRNA) на короткие фрагменты порядка 21—25 нуклеотидов, называемые siRNA. Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», эта одноцепочечная РНК далее включается в состав РНК-белкового комплекса RISC. В результате активности RISC одноцепочечный фрагмент РНК соединяется с комплементарной последовательностью молекулы мРНК и вызывает разрезание мРНК белком Argonaute либо ингибирование трансляции и/или деаденилирование мРНК. Эти события приводят к подавлению экспрессии (сайленсингу) соответствующего гена, эффективность которого ограничена концентрациями молекул малых РНК — siRNA и микроРНК.

Селективный эффект РНК-интерференции на экспрессию генов делает RNAi полезным инструментом для исследований с использованием культур клеток и живых организмов, так как синтетические двуцепочечные РНК, введённые в клетки, вызывают супрессию специфических генов. RNAi используется для крупномасштабных исследований в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии и медицины. Так, например, РНК-интерференцию используют для систематического «выключения» генов в клетках и установления функций генов при изучении деления клетки.

Источник

РНК-интерференция. Клин клином.

«Много» – это не всегда «хорошо». Например, когда речь идет о вирусных белках. В этом случае остановить процесс белкового синтеза – жизненная необходимость для зараженной клетки. И она как опытный гомеопат начинает излечивать «подобное подобным».

В 2006 г. Нобелевской премии по физиологии и медицине были удостоены американские исследователи Эндрю Файр и Крэйг Мэллоу за открытие явления РНК-интерференции. Признание пришло к ним необычайно быстро – всего через восемь лет после опубликования в журнале Nature результатов их исследований, показывающих, что матричную РНК можно разрушить с помощью другой молекулы РНК, двуцепочечной. Инъекция такой дцРНК, комплементарной мРНК мышечного белка unc-22, блокировала синтез этого белка посредством разрушения самой матричной РНК.

С явлением интерференции (от лат. inter – между и ferens (ferentis) – несущий) большинство из нас знакомо из курса физики: вспомним яркие пятна нефтяных разводов, причудливо расходящиеся по воде круги от брошенного камня. Однако этот термин, обозначающий взаимодействие, «наложение» по определенным законам одинаковых по своей природе объектов, встречается и в психологии, и в фонетике, и в биологии

Механизм разрушения мРНК при помощи дцРНК строго избирателен. Попадая в клетку, длинные дцРНК связываются с клеточным ферментом Дайсер (Dicer – от англий-ского dice – нарезать) – ключевым белком в механизме РНК-интерференции – и разрезаются на короткие фрагменты, так называемые короткие интерферирующие РНК (siRNAs). Последние связываются с клеточным комплексом RISC, способным разрушать молекулы РНК, и направляют его только к тем мРНК, которые «узнают» по принципу гомологии нуклеотидных последовательностей. Таким образом обеспечивается специфичность РНК-интерференции.

Возникает вопрос, откуда же берутся длинные двуцепочечные РНК, запускающие механизм РНК-интерференции – ведь в норме в клетках млекопитающих они не синтезируются. Одним из путей попадания таких РНК в клетку может быть вирусная инфекция. Геном многих известных вирусов состоит именно из такой двуцепочечной РНК (а не ДНК, как у большинства живых организмов). Кроме того, подобные молекулы могут синтезироваться в клетке в качестве промежуточного продукта в процессе размножения некоторых вирусов. Поэтому появление двуцепочечной РНК является для клетки сигналом: «Опасность!» В ответ на него защитные системы клетки включают механизм уничтожения чужеродной генетической информации. Вирусная РНК разрушается, и процесс синтеза вирусных белков в клетке блокируется.

Двуцепочечные РНК участвуют в функционировании двух важнейших клеточных систем – противовирусной защиты и регуляции экспрессии генов

Следует отметить, что разрушением вирусной РНК защитные действия клетки не ограничиваются. Двуцепочечные РНК способны также стимулировать синтез интерферонов и цитокинов, оказывающих противовирусный эффект как на инфицированную, так и на соседние с ней клетки, подготавливая их к встрече с вирусом и активируя механизмы их клеточного иммунитета.

В последние годы было показано, что в клетке могут синтезироваться и свои собственные дцРНК, отличные по структуре от вирусных. Действуя по механизму РНК-интерференции, эти так называемые микроРНК могут вызывать остановку трансляции клеточных мРНК, блокируя синтез кодируемых ими белков. Таким образом, клетка может «выключать» гены, работа которых не нужна в данный момент. Следовательно, клетка, используя микроРНК, закодированные в ее собственном геноме, может регулировать экспрессию генов, реализуя свою генетическую программу развития.

Осознав, что с помощью малых интерферирующих РНК клетка справляется с целым рядом встающих перед ней проблем – от защиты от чужеродной генетической информации до регулировки программы развития клетки – исследователи поставили перед собой вопрос: нельзя ли использовать короткие синтетические молекулы РНК, гомологичные матричным РНК клетки, для разрушения последних. Такая возможность давала бы в руки ученым бесценный инструмент, способный регулировать экспрессию любого интересующего их гена. Кроме того, эти короткие олигорибонуклеотиды уже не распознаются клеткой как инфекционно опасные компоненты вирусного генома. Они не активируют клеточные механизмы противовирусной защиты и направлены исключительно на разрушение мРНК, гомологичной последовательности интерферирующей РНК.

Эксперименты показали, что это возможно, и сегодня такие синтетические молекулы, действующие по принципу РНК-интерференции, уже используются для регуляции экспрессии многих генов. Они действуют очень избирательно, разрушая только «нужные» молекулы мРНК, и проявляют активность в чрезвычайно низких концентрациях. Появление такого мощнейшего инструмента открыло для исследователей новые горизонты в области разработки целого спектра препаратов, подавляющих активность практически любых генов, в том числе вирусных и «опухолевых».

В одной лишь онкологии потенциальными мишенями для интерферирующих РНК могут являться мРНК, кодирующие различные классы белковых молекул, участвующих в процессе злокачественной трансформации. Вот только перечень классов подобных мишеней для терапевтического применения микроРНК: регуляторы клеточного цикла, ангиогенеза (роста сосудов, необходимых для питания опухоли), метастазирования и старения, белки, участвующие в блокировании апоптоза (программируемой гибели клеток), белки-иммуносупрессоры, мешающие организму самому бороться с раковыми клетками, а также белки, ответственные за устойчивость раковых клеток к химио- и радиотерапии.

Универсальная технология

При лечении ряда раковых заболеваний серьезной проблемой является устойчивость клеток опухоли к лекарственным препаратам. Такие раковые клетки способны выживать и размножаться в присутствии высоких концентраций цитостатических препаратов, когда обыкновенные, чувствительные к лекарствам опухолевые клетки неизбежно погибают.

Такой синдром множественной лекарственной устойчивости связан с гиперэкспрессией клеточного гена MDR1, кодирующего P-гликопротеин. Этот транспортный белок работает как мембранный насос, «откачивающий» лекарственные препараты из цитоплазмы и таким образом снижающий их концентрацию в клетке.

Действие этого молекулярного насоса можно блокировать с помощью специальных химических веществ-ингибиторов. Но вряд ли это можно считать оптимальным решением проблемы: такие вещества сами по себе довольно токсичны и усугубляют тяжесть побочных эффектов химиотерапии. Выход из ситуации — создание таких лекарственных средств, которые устраняли бы первопричину синдрома устойчивости, то есть подавляли бы экспрессию гена MDR1.

Такие препараты на основе малых интерферирующих РНК были разработаны в новосибирском Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Они представляют собой комплексы синтетических олигорибонуклеотидов, гомологичных различным участкам матричной РНК гена MDR1.

Для получения наиболее действенных малых интерферирующих РНК ими обрабатывали раковые клетки, обладающие устойчивостью к цитостатику винбластину, и отбирали те молекулы, низкие концентрации которых восстанавливали чувствительность опухолевых клеток к препарату, что приводило к гибели последних. Обработка самой эффективной из полученных siРНК снижала количество P-гликопротеина в раковых клетках в 20 раз уже через трое суток!

С использованием этого же подхода в ИХБФМ были получены ингибиторы и других «опухолевых» генов – протоонкогенов семейства MYC, играющих важную роль в регуляции клеточного цикла. Известно, что гиперэкспрессия генов c- и N-myc является одной из причин возникновения таких злокачественных опухолей, как нейробластомы. Клетки последних представляют собой не полностью дифференцированные нейральные клетки, продолжающие неконтролируемо делиться из-за нарушения генной экспрессии. Эти опухоли, нередко обнаруживающиеся у детей, далеко не всегда поддаются лечению.

В ходе экспериментов с серией 21-звенных интерферирующих РНК, направленных на подавление экспрессии протоонкогена c-myc, была получена высокоэффективная молекула, введение которой в клетки вызывает двадцатикратное снижение количества мРНК опухолевого гена по сравнению с контролем. В результате уже через двое суток число раковых клеток относительно уменьшилось в четыре раза.

Более того, в институте была получена siРНК, способная подавлять экспрессию сразу двух онкогенов, c-myc и N-myc. Этот препарат оказался эффективен против разных типов нейробластом, в том числе и устойчивых к лечению обычными противоопухолевыми средствами.

Полученные интерферирующие РНК могут рассматриваться как прототипы лекарственных препаратов, способных многократно повышать эффективность химиотерапии раковых заболеваний. Впрочем, до использования в медицинской практике этим препаратам еще предстоят долгий путь испытаний на лабораторных животных, а затем доклиническая и клиническая апробация.

«Химия» во благо

Для того чтобы интерферирующие РНК стали настоящими лекарствами, необходимо решить две проблемы: «защиты» и доставки РНК.

Первая связана с нестабильностью молекул РНК в крови и других биологических жидкостях. Это свойство обусловлено самой ролью РНК как переносчика генетической информации, количество которого должно подлежать быстрой регуляции. Ферменты РНКазы, содержащиеся как внутри клеток, так и во внеклеточной среде, эффективно расщепляют молекулы РНК, выполняя роль такого регулятора. Для защиты РНК от их действия природные нуклеотиды в ее составе заменяют на их химически модифицированные аналоги, придающие РНК устойчивость к действию ферментов. Однако такая замена может стать палкой о двух концах: сама биологическая активность интерферирующей РНК может снизиться либо быть полностью потеряна.

Поиски новых аналогов нуклеотидов, лишенных этих недостатков, ведутся во всем мире. Алгоритм получения нуклеазоустойчивых интерферирующих РНК, разработанный в ИХБФМ, основан на картировании чувствительных к рибонуклеазам участков молекулы siРНК и их направленной защите с помощью химически модифицированных аналогов нуклеотидов. В результате «адресно-защищенная» РНК сохраняет свою активность в присутствии 5 % сыворотки в течение восьми часов, в то время как немодифицированная siРНК полностью деградирует менее, чем за 5 минут. Благодаря приобретенной устойчивости значительно сокращается кратность введения новой дозы, необходимой для поддержания биологического эффекта.

Поиск новых «молекул-транспортеров» и «молекул-упаковщиков» для доставки интерферирующих РНК сейчас активно ведется в лабораториях всего мира, включая Россию. Уже в ближайшее время можно ожидать результатов, ознаменующих «прорыв» в эру новых технологий создания лекарств

Вторая проблема – создание средств доставки препарата в клетки и ткани. Для того чтобы комплексы, содержащие siРНК, попадали точно «по адресу», в их состав вводят специальные молекулы, которые и «узнают» клетки определенного типа. В качестве таких молекул могут выступать антитела, специфичность связывания которых чрезвычайно высока.

Преодоление клеточной мембраны также представляет проблему для любых заряженных молекул, в том числе и олигорибонуклеотидов. Здесь на помощь может прийти использование в качестве средств доставки препаратов катионных липидов и полимеров, которые образуют с интерферирующими РНК комплексы определенного размера. Такие комплексы способны проникать в клетки благодаря природным механизмам транспорта веществ. Другим перспективным подходом является присоединение к siРНК молекул, заведомо обладающих способностью проникать в клетки, таких как холестерин, фолат и других природных молекул, необходимых для функционирования клетки.

Проблема доставки интерферирующих РНК в некоторые типы клеток и тканей уже успешно решена, и эффективность подавления экспрессии генов-мишеней подтверждена на экспериментальных животных. Однако, как отмечают специалисты, текущее состояние дел в этой области следует считать обнадеживающим, но скромным результатом. Именно от разработки адекватных средств и схем доставки лекарственных молекул РНК в самые разные типы клеток при различных заболеваниях зависит то, как скоро всю мощь этого нового подхода в лечении удастся почувствовать на практике.

Логашенко Е. Б., Владимирова А. В., Зенков А. Н., Репкова М. Н., Веньяминова А. Г., Черноловская Е. Л., Власов В. В. (2005) Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости с помощью малых интерферирующих РНК. // Известия АН, серия химическая, 2, 41—44.

Aronin N. (2006) Target selectivity in mRNA silencing. Gene Therapy, 13, 509—516.

Corey D. (2007) Chemical modification: the key to clinical application of RNA interference? // The Journal of Clinical Investigation, 117, 3615—3622.

Grimm D. and Kay M. (2007) Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time? The Journal of Clinical Investigation, 117, 3633—3641.

Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S. E., and Mello C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature, 391, 806—811.

Kabilova T. O., Chernolovskaya E. L., Vladimirova A. V., Vlassov V. V. (2006) Inhibition of Human Carcinoma and Neuroblastoma Cell Proliferation by anti c-Myc siRNA // Oligonucleotides, 16, 15—25.

Источник

Подавление экспрессии мутантного гена TTR, вызывающего семейную амилоидную полинейропатию: РНК-индуцируемый комплекс выключения гена (RISC) совместно с интерферирующей РНК (siRNA) бесстрашно летит навстречу злобной патогенной мРНК-мишени, предвкушая расправу.

иллюстрация авторов статьи

Авторы

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Патисиран — первый препарат на основе РНК-интерференции, одобренный FDA, — не только спасает жизни людей, страдающих амилоидной полинейропатией. Он начинает писать новую страницу в терапии, о которой мечтали с момента открытия этого механизма подавления экспрессии генов, то есть уже более 20 лет. С какими сложностями сталкивались ученые и как их преодолели? Об этом вы можете узнать в нашей статье.

Конкурс «био/мол/текст»-2018

Эта работа опубликована в номинации «Биофармацевтика» конкурса «био/мол/текст»-2018.

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.

Амилоиды в первую очередь ассоциируются с болезнью Альцгеймера. Однако амилоидозы — это целая группа заболеваний, связанная с неправильным сворачиванием белка, приводящим к накоплению в тканях нерастворимых фибрилл. Подробнее об этом написано в статье «На руинах памяти: настоящее и будущее болезни Альцгеймера» [1].

Семейная амилоидная полинейропатия (FAP), или наследственный транстиретиновый амилоидоз (hATTR), связана с различными точечными мутациями в гене, кодирующем транстиретин (TTR). В норме он вырабатывается гепатоцитами и осуществляет транспорт витамина А вместе с тиреоидными гормонами к периферическим тканям. Определенные мутации способствуют тому, что мономеры этого белка неправильно сворачиваются и образуют аморфные олигомеры, которые сливаются в фибриллы (рис. 1). По некоторым данным, именно небольшие олигомеры обладают наибольшей токсичностью в клетках [2].

Рисунок 1. Синтез мутантного варианта транстиретина и влияние на этот процесс патисирана. Без лечения мРНК TTR транслируется в белок, который в норме состоит из четырех субъединиц. Мутантные мономеры белка сворачиваются неправильным образом и образуют аморфные олигомеры, кластеры нефиксированного размера, сливающиеся в фибриллы. Образование фибрилл может привести к развитию нейродегенеративных заболеваний и проблемам с сердечно-сосудистой системой.

Рисунок 2. Связь генотипа с клиническими проявлениями при транстиретиновом амилоидозе (hATTR). До появления патисирана спасением для таких пациентов являлась трансплантация печени. В Европе также используют препарат тафамидис, который стабилизирует транстиретин. Он связывается с тетрамером и не дает ему диссоциировать на мономеры. Однако в США он так и не смог получить одобрение [5].

Человечество стремится познать природу, которая порой нашептывает удивительные решения многих наших задач. Приоткрывая завесу тайны жизни организмов, мы видим изумительные механизмы, созданные эволюцией. Так, например, система CRISPR/Cas, обеспечивающая адаптивный иммунитет прокариот, уже не один год вдохновляет ученых на создание генной терапии с ее помощью. О системе можно почитать в статьях «Просто о сложном: CRISPR/ Cas» [6] и «Когда ослепшие прозреют?» [7].

А вот один из молекулярных механизмов эукариот уже подарил нам первое лекарство и надежду на лечение огромного спектра заболеваний. Попробуем разобраться в тернистом двадцатилетнем пути с момента открытия РНК-интерференции до первого официально одобренного FDA (Food and Drug Administration, Управление США по контролю за лекарствами и пищевыми продуктами) препарата.

Итак, как же эукариоты «выключают» гены и зачем?

Воздействовать на белок мы можем принципиально тремя способами. Можно придумать молекулу, которая будет связываться с уже синтезированным белком, препятствуя его работе, или, напротив, побуждая его к действию. Так работает большинство лекарств, например, известный анальгетик и жаропонижающее средство ибупрофен ингибирует фермент циклооксигеназу (ЦОГ), уменьшая выработку простагландинов — веществ, ответственных за воспаление [20].

Но ученые мечтают о новых возможностях: о выключении таргетного гена, вызывающего генетическое заболевание, на уровне ДНК (нокаут) и о выключении без затрагивания самой последовательности ДНК на уровне РНК (нокдаун).

Рисунок 3. Центральная догма молекулярной биологии. Генетическая информация, закодированная в ДНК, переходит в мРНК, и уже с нее синтезируется полипептидная последовательность. Нуклеотиды одной цепочки нуклеиновой кислоты могут быть соединены с нуклеотидами другой по правилу комплементарности. В процессе транскрипции синтезируется смысловая цепь мРНК, и, зная ее последовательность, мы можем синтезировать комплементарную ей цепочку, или антисмысловую цепь.

Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings

В своей работе 1996 года Эндрю Файр (Andrew Fire) и Крейг Мело (Craig Mello) на модельном объекте Caenorhabditis elegans (нематоде) показали, что при внесении двухцепочечной РНК можно полностью «выключить» ген. Как оказалось, происходит это от того, что антисмысловая цепь РНК, комплементарная гену-мишени, вместо ожидаемого повышения экспрессии гена (ведь мы вносим матрицу для трансляции белка) блокирует его синтез. Немногим позже, в 2006 году, за первое применение РНК-интерференции (RNAi) ученые получили Нобелевскую премию [8].

Процесс начинается с того, что поступившая в клетку экзогенная двухцепочечная РНК связывается с рибонуклеазой Dicer (да-да, как та самая овощерезка), которая нарезает ее на небольшие фрагменты длиной 20–25 пар нуклеотидов, с двумя неспаренными основаниями на каждом конце. Такая длина, видимо, оказалась оптимальной для специфического связывания с мишенью. Эти фрагменты взаимодействуют с белковым комплексом RISC, который отщепляет одну из цепей РНК, оставляя вторую на съедение нуклеазам (ферментам, расщепляющим нуклеиновые кислоты), и путешествует с ней по клетке в поисках таргетной мРНК. Обнаружив ее, белок Аргонавт из комплекса RISC разрезает свою мишень (рис. 1 и 4).

Рисунок 4. РНК-интерференция. Сверху представлена схема строения малой интерферирующей РНК (siRNA). Экзогенная двухцепочечная РНК разрезается ферментом Dicer и встраивается, расплетаясь, в белковый комплекс RISC. Готовый к работе, совместно с siRNA, он путешествует по клетке. При встрече с комплементарной мРНК комплекс индуцирует ее деградацию. Таким образом, клетка уничтожает потенциально вирусную РНК, препятствуя синтезу вирусных белков, а также борется с транспозонами.

Этот механизм выполняет защитную функцию против вирусов, которые стремятся заполучить контроль над клеткой, предоставляя ее белковой машинерии инструкции по производству вирусных агентов. Также интерферирующие РНК могут быть полезны клетке в борьбе с мобильными генетическими элементами, которые активируются при делении клетки и нарушают нормальную работу ее генетического аппарата.

Также стоит отметить, что РНК-интерференция является не единственным механизмом регуляции экспрессии генов. Для трансляции необходимо, чтобы мРНК была одноцепочечной, поэтому при попадании одноцепочечной антисмысловой РНК в клетку блокируется процесс синтеза белка, а также активируется РНКаза H, разрушающая транскрипт.

В каких случаях мы можем использовать этот изящный механизм?

Нокаут генов активно применяется в лабораторной практике, в биоинженерии и биотехнологии. Геном можно редактировать с помощью рестриктаз с последующим сшиванием лигазами, воздействовать ретровирусами, несущими правильную копию поврежденного гена, а также использовать уже упоминавшийся метод геномного редактирования с помощью CRISPR-Cas9 — системы белков и РНК. Смотрите подробнее в статьях «12 методов в картинках: генная инженерия. Часть II: инструменты и техники» [11] и «Человек генномодифицированный / Homo genere mutatio» [12].

Проблема с применением большинства таких методов для лечения человека заключается в низкой селективности редактирования, что может вносить дополнительные мутации в геном. Клетки могут перерождаться в раковые, уходить в апоптоз. Данные побочные действия затрудняют применение описанных подходов для лечения генетических заболеваний человека.

Всего этого можно избежать, выключая гены с помощью РНК-интерференции. Очень перспективна разработка антивирусных лекарств, препятствующих связыванию вирусных белков с таргетной клеткой, а также противоопухолевых препаратов.

Так что же останавливало ученых в реализации этой простой идеи?

Все, кто работал в лаборатории с РНК, знают ее коварство: она быстро деградирует под действием РНКаз, находящихся на поверхности кожи, в слюне, и в большом количестве в кровяном русле. Получается, что препарат просто не успевает добраться до нужных клеток, гены которых необходимо выключить с помощью RNAi.

После долгих и дорогостоящих попыток фармкомпании практически потеряли надежду на терапевтическое применение этого механизма. Однако решение было найдено [13]. Сегодня у одной только компании Alnylam известно семь препаратов на основе РНК-интерференции, находящихся на разных стадиях клинических испытаний (табл. 1).

Мишенями таких лекарств являются не только заболевания, связанные с образованием амилоидных бляшек, но и широкий спектр системных дисфункций. Примеры лекарств, разрабатываемых для лечения таких заболеваний, можно найти в статье «Есть ли смысл в антисенсах?» [10].

Патисиран — первый олигонуклеотидный препарат на основе РНК-интерференции

Лекарственная форма патисирана (коммерческое название — Onpattro, «Онпаттро») состоит из РНК, завернутой в липидные наночастицы (LNPs). При создании действующего вещества разработчики использовали короткие, по 21 паре нуклеотидов, двухцепочечные РНК, которые предварительно модифицировали метильной группой, присоединяемой к атомам кислорода (О-метилировали) [15], и защищали с 3′ конца для увеличения стабильности молекулы (рис. 5).

Как вообще можно увеличить стабильность РНК?

Этого можно добиться разными способами. Например, на практике используют комбинации метилирования, блокирования конца или «слабых» мест молекулы с помощью специальных белков и реагентов, а также формирование вокруг лекарственной молекулы защитной оболочки.

Рисунок 5. Нуклеотидная составляющая патисирана представляет собой короткую 21-буквенную двуцепочечную РНК из смысловой и антисмысловой цепей, которая комплементарна таргетному гену транстиретина (TTR). Для бóльшей устойчивости, некоторые из нуклеотидов О-метилированы (Um, Cm), а на 3′ концах пришиты два тимидина (dT). Молекулярная формула лекарства — C₄₁₂H₄₈₀N₁₄₈Na₄₀O₂₉₀P₄₀. Молекулярный вес составляет 14 304 Да.

Впервые система доставки малых двухцепочных РНК была предложена в 2010 году и после развивалась вплоть до первого успешного клинического испытания в 2016, которое показало возможность применения РНК-интерференции для лечения генетических заболеваний человека [13].

Липидные наночастицы, защищающие РНК, состоят из внешнего слоя, образованного липидами с полиэтиленгликолем и холестерином, и внутренней полости, заполненной буфером, в которой находятся окруженные катионными частицами интерферирующие агенты (рис. 6).

Рисунок 6. Строение липидных наночастиц. Для создания липидных наночастиц эмпирически был разработан специальный протокол, сочетающий различные буферы и типы липидов: смешиваются ионизированные катионные липиды с siRNA в буфере с низкой ионной силой, за счет чего РНК сближаются с липидами и собираются в наночастицы (разноименные заряды катионных липидов и РНК притягиваются). Далее собранные структуры покрываются вспомогательными липидами, холестерином и липидами с полиэтиленгликолем (ПЭГ).

Таким образом, препарат таргетно доставляется в гепатоциты — клетки, продуцирующие амилоидный транстиретин.

Клинические испытания

Любое лекарство проходит через несколько так называемых фаз клинических испытаний перед тем, как будет допущено к продаже и широкому клиническому применению. Узнать больше можно из статей спецпроекта «Клинические испытания».

Для патисирана все клинические испытания прошли успешно. В последней, третьей фазе участвовало 225 пациентов с наследственным транстиретиновым амилоидозом (hATTR), из которых 77 получали плацебо. Ключевым показателем оценки состояния пациентов являлась модифицированная шкала ухудшения нейропатии (mNIS+7). Также использовали тест на ходьбу на расстояние 10 м, оценку индекса массы тела и опрос о качестве жизни. Наблюдение продолжалось в течение 18 месяцев. mNIS+7 ранжируется от 0 до 304 баллов: чем больше, тем хуже состояние пациента (рис. 7). По всем показателям выявили значимое улучшение состояния пациентов по сравнению с группой, принимавшей плацебо [16].

Рисунок 7. Динамика изменений средних значений модифицированной шкалы ухудшения нейропатии (mNIS+7). Разница между группами составляет 34,0 пунктов при p

Во время клинических испытаний возникли побочные эффекты: у 10% пациентов, принимавших лекарство, и 3%, принимавших плацебо, выявили инфекции верхних дыхательных путей. У всех пациентов наблюдали падение концентрации витамина А в крови (вспомним функции транстиретина).

FDA одобрило лекарство для всех стадий заболевания 10 августа 2018 года — так, патисиран стал не только первым одобренным препаратом для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза, но и первым одобренным средством, в механизме работы которого лежит РНК-интерференция [17].

Комитет по лекарственным средствам для человека (CHMP), входящий в Европейское агентство лекарственных средств (EMA), рекомендовал предоставить разрешение на применение патисирана для лечения наследственного транстиретин-опосредованного амилоидоза у взрослых пациентов с полинейропатией 1 или 2 стадий. Значимого улучшения состояния пациентов с 3 стадией заболевания, по результатам клинических тестов и судя по комментариям представителя компании, достичь не удалось.

Лекарство будет доступно в виде раствора для внутривенного введения с концентрацией активного компонента 2 мг/мл. Примечательна периодичность инъекций: один раз в три недели.

Компания Alnylam предоставляет несколько типов финансовых тарифов для пациентов разных категорий. Рассмотрим два из них:

Нам удалось узнать подробнее о планах компании Alnylam на расширение рынка препарата. На данный момент патисиран доступен на территории США, о продаже на территории России речи пока не идет. Авторы надеются, что с течением времени терапия станет ближе для бóльшего числа больных.

Кто нас ждет теперь?

Как мы смогли убедиться, создание RNAi-препаратов сопряжено с огромными трудностями, связанными с доставкой хрупких РНК к клеткам. Сегодня остается еще много вопросов касательно дизайна и применения липидных наночастиц.

Это перспективное направление открывает, в первую очередь, невероятные возможности для лечения генетических заболеваний человека. Доказанная эффективность патисирана способствует дальнейшему исследованию РНК-интерферирующих агентов, их применению в клинической практике и еще большему накоплению багажа знаний. Возможно, когда-нибудь, мы увидим в аптеках волшебные лекарства против всего, а, может быть, приблизимся к «Дивному новому миру» Олдоса Хаксли. Время покажет.

Источник