В последнее время наблюдается увеличение числа сосудистых заболеваний и цереброваскулярных нарушений центральной нервной системы. В лечении данных патологий важная роль принадлежит церебропротекторным, ноотропным и стресс-протекторным препаратам.
Исследования показали, что активный фармакологический ингредиент препарата «Лизаргам» (Nα-ацетил-D-лизил-лизил-аргинил-аргинил-амид) обладает нейропротекторным действием [1]. Введение препарата нормализует уровни цитокинов в головном мозге, а также обладает антиапоптотическим действием, поскольку может ограничивать развитие апоптоза в головном мозге после воздействия оксида углерода. Защитное действие исследуемого пептида характеризуется также нейротрофическим компонентом. Таким образом, препарат «Лизаргам» обладает высокой нейропротекторной эффективностью in vivo.
Материалы и методы исследования
В данной работе использовали готовую лекарственную форму (ГЛФ) «Лизаргам, спрей назальный дозированный 0,5% и 1,0%». Подробная характеристика ГЛФ приведена нами ранее [2]. Терапевтическую дозу препарата для человека (20 мкг/кг) высчитывали в соответствии с руководством Т.А. Гуськовой [2; 3].
Животные содержались в виварии согласно санитарно-эпидемиологическим требованиям от 29.08.2014 г., условия соответствовали Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.). Эксперименты проводились с разрешения биоэтической комиссии института. В качестве контроля во всех экспериментах использовали физиологический раствор (стерильный 0,9% раствор хлорида натрия, ФР).
Оценку репродуктивной токсичности (генеративной функции) проводили на белых беспородных крысах обоего пола (180-200 г, 9-10 недель) [4; 5]. Препарат «Лизаргам» вводили самкам (n=20) ежедневно интраназально (и/н) в дозе 5 мг/кг (максимальная доза, использованная в эксперименте по изучению хронической токсичности) в течение 15 дней (3 эстральных цикла). Самцам препарат вводили (n=10) и/н в дозе 5 мг/кг в течение всего периода сперматогенеза (48 дней). После введения препарата самок помещали с самцами на 2 эстральных цикла (10 дней). Взвешивание крыс проводили до начала эксперимента (фоновые значения), после завершения введения препарата и перед эвтаназией (самки). Забой и морфологическое исследование репродуктивной системы самок проводили на 20-й день после оплодотворения. Состояние внутренних органов и костной системы плодов исследовали по методу Вильсона или по модифицированному методу Даусона [4].
При изучении генотоксичности руководствовались рекомендациями действующих методических документов [4; 8]. Мутагенные свойства препарата «Лизаргам» изучали in vitro с использованием чашечного метода учета мутаций в тесте Эймса.
Проводили изучение индукции доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей (CBA x С57В1). В опытной и контрольной группах было по 15 самцов. В опытной группе «Лизаргам» вводили и/н в дозе 6 мг/кг однократно. К каждому самцу подсаживали по 3 интактных виргинных самки, затем заменяли новыми через 7 дней. На 15-17-й день беременности после эвтаназии самок вскрывали. Уровень постимплантационных потерь (А) подсчитывали по формуле:
Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Excel-2007. Полученные данные представляли в виде средних значении и ошибок среднего (M±m). Различия между группами оценивали с помощью Т-критерия Стьюдента, а также теста Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
1. Оценка репродуктивной токсичности
1.1. Генеративная функция
После введения препарата ни в одной из групп не наблюдалось гибели крыс. Не происходило снижение прироста массы тела, а также не было выявлено изменений в поведении животных. При изучении репродуктивной системы у самок не было обнаружено никаких патологических изменений. В каждой из групп было по 18 беременных самок, при этом индекс фертильности составил 90% и в опытной, и в контрольной группе. Результаты оценки параметров репродуктивной системы самок приведены на рисунке 1.
Рис. 1. Влияние препарата «Лизаргам» на параметры репродуктивной системы самок крыс
1.2. Изучение возможного эмбриотоксического действия
На первом этапе проводили оценку возможного действия препарата в пренатальный период развития. При и/н введении препарата самкам в дозах 1 и 5 мг/кг в течение 19 дней в репродуктивной системе самок не было обнаружено патологических изменений. Также не было выявлено нарушений в состоянии плодов.
На втором этапе изучали возможное постнатальное действие препарата. Результаты показали, что после введения препарата крысам не было обнаружено патологических изменений в развитии их потомства. Оценка количественных показателей, параметров физического развития, сроков формирования сенсорно-двигательных рефлексов и эмоционально-двигательного поведения неполовозрелого потомства самок крыс, получавших «Лизаргам», не выявила различий между контрольными и опытными группами (таблицы 1-3, рисунки 2, 3).
Количественные показатели потомства, рожденного от самок крыс, получавших препарат «Лизаргам»
Несмотря на то, что многие пациенты до сих пор считают все лекарства невероятно вредными, способными оказывать токсическое влияние на различные органы, это совсем не так. Все препараты, прежде чем попасть в аптеки, тщательно проверяются и исследуются, чтобы исключить опасное воздействие на организм человека. Безусловно, есть список лекарств, которые имеют достаточно серьезные побочные эффекты, однако показания к их применению строго ограничены, и применяются они лишь при очень серьезных заболеваниях.
Борьба за репродуктивное здоровье
Одним из важных аспектов, который попадает под внимание подобных доклинических исследований, является репродуктивная токсичность препарата. Под этим термином подразумевается способность вещества оказывать токсическое воздействие на репродуктивные органы мужчины или женщины с последующим снижением половой функции и способности к размножению, а также патологическое воздействие на развитие потомства.
Чтобы исключить подобные нежелательные патологии, проводятся необходимые доклинические исследования репродуктивной токсичности препаратов. Для этого проводятся эксперименты на различных животных, таких как:
Такая работа позволяет определить репродуктивную токсичность препарата, что в дальнейшем даст возможность предотвратить развитие бесплодия у пациентов, а также негативное влияние на плод, с последующим влиянием на новорожденного ребенка в случае применения лекарственного средства во время беременности. В результате, если репродуктивная токсичность вещества превышает допустимые нормы, такой препарат будет отправлен на усовершенствование или же будет снят с производства на этапе доклинического исследования. Также возможен поиск такой дозы, при которой сохраняется необходимый терапевтический эффект, а репродуктивная токсичность остается на приемлемом уровне.
Изучение репродуктивной токсичности лекарственных средств в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К», 2012, FDA – Integration of Study Results to Assess Concerns about Human Reproductive and Developmental Toxicities, ICH – S5(R2);
Оценка генеративной токсичности, эмбрио- и фетотоксичности по показателям: предимплантационная смертность (эмбриотоксическое действие) и постимплантационная смертность (фетотоксическое действие) с оценкой тератогенного действия:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУН ИТ ФМБА России)
Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.
199406, Санкт-Петербург, ул.Гаванская, д. 49, корп.2
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ РЕПРОДУКТИВНОЙ ТОКСИЧНОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
Настоящие «Методические рекомендации» составлены, с учетом многолетнего опыта работы, ряда учреждений, занимающихся изучением влияния химических соединений на процессы репродукции, анализа отечественной и зарубежной литературы, рекомендаций ВОЗ «Принци-. пы оценки риска нарушений развития плода в связи с воздействием химических веществ во время беременности», требований FDA (США), материалов СРМР (ЕС), MHW (Япония), материалов согласительной конференции от июля 1993 года по координации доклинических токсикологических испытаний в странах Европы, Японии и США. Изучение репродуктивной токсичности включает разделы.: влияние на генеративную функцию, изучение эмбрио- и фетотоксического действия, регистрируемого в антенаталъном и по-стнатальном периодах развития, а также, при необходимости, изучение возможного неблагоприятного действия фармакологического вещества на потомство в период грудного вскармливания.
1. ИЗУЧЕНИЕ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ГЕНЕРАТИВНУЮ ФУНКЦИЮ
1.1. Задачей этого этапа исследований является выявление возможного отрицательного действия фармакологического вещества на стадии прогенеза (формирование мужских и женских гамет), нарушений полового поведения и транспорта продуктов зачатия.
1.2. Изучению должны подвергаться все новые оригинальные фармакологические вещества. Исключение может быть сделано для веществ с противоопухо-леой активностью, если их применение ограничивается только онкологической практикой и для веществ, рекомендуемых по жизненным показаниям. Исследуются, также вспомогательные вещества, не разрешенные для медицинского применения.
1.3. К моменту начала тестирования необходимо располагать сведениями о физико-химических свойствах вещества, дозах (летальная, эффективная, рекомендуемая для клинических испытаний), признаках интоксикации, специфических для данного вещества, рекомендуемых способах введения, профиле фармакологического действия, показаниях и схемах применения препарата в клинике. Желательно также иметь данные о фармакокинетике фармакологического вещества.
1.4. Изучению подлежит субстанция фармакологического вещества. В тех случаях, когда использование субстанции не обеспечивает преимущества перед лекарственной формой в отношении возможности использован ил широкого диапазона доз и удобства введения препарата экспериментальным животным, целесообразно проводить изучение репродуктивной токсичности лекарственной формы. При комбинации нескольких лекарственных веществ в одной лекарственной форме, следует изучить комбинацию в целом только в том случае, если один из компонентов в этом плане не изучен.
1.6. Изучаемое вещество необходимо вводить тем способом, который предусмотрен при клиническом применении. При пероральном способе применения вещество следует вводить зондом. Желательно предусмотреть дополнительную группу животных для выяснения обратимости эффекта в случае его обнаружения.
1.9. При статистической обработке за единицу наблюдения принимают помет, т.е. результаты, полученные при вскрытии одной самки. Сведения о методах статистического анализа, использованных при обработке результатов, должны быть указаны в отчете.
2. ИЗУЧЕНИЕ ЭМБРИО- И ФЕТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ, РЕГИСТРИРУЕМОГО В АНТЕНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ
2.1. Под эмбриотоксическими свойствами понимают способность того или иного вещества оказывать токсическое действие на развивающиеся зародыши. Эмбриотоксичность может проявляться как в повышении уровня эмбриональной смертности (эмбриоле-тальное действие), так и в виде анатомических, гистологических, цитологических, биохимических,, ией-рофизиологических отклонений от нормы, проявляющихся до или после рождения (тератогенное действие). Кроме того, эмбрио- и фетотоксичнсть может проявляться в изменении массы тела, краниокаудаль-ного размера плодов, задержке оссификации скелета (общая задержка развития), увеличении перинаталь-ной смертности.
2.2. Исследованию на наличие эмбриотоксических свойств должны подвергаться все новые фармакологические вещества, которые могут быть назначены женщинам в период беременности, а также все неиспользовавшиеся раннее в медицинской практике соединения, которые в качестве вспомогательных веществ включаются в лекарственную форму новых или уже применяемых лекарств. Положения, изложенные в пунктах 1.3, 1.4 должны соблюдаться и при изучении эмбриотоксического действия.
2.3. Изучаемые вещества необходимо вводить тем же способом, который предусмотрен при клиническом применении. При пероральном способе применения вещество следует вводить зондом. По возможности следует избегать внутрибрюшинного введения вещества.
2.4. Экспериментальные исследования должны включать изучение состояния плодов к концу анте-натального периода развития.
2.5. Поскольку чувствительность зародыша к токсическому действию фармакологических веществ зависит от стадии развития, и при этом зародыши, находящиеся на одной стадии развития могут различаться в чувствительности к действию различных по структуре веществ, сроки введения вещества беременным самкам должны охватывать весь период беременности.
2.6. Дозы тестируемого вещества рассчитывают на единицу массы тела самки. Наиболее целесообразным, с точки зрения последующей интерпретации результатов, следует проводить тестирование вещества, используя не менее двух-трех доз (см. п. 1.6,).
2.9.1 Тестирование на крысах Каждая группа крыс, как в опыте, так и в контроле должна состоять не менее, чем из 15-20 беременных животных. Первым днем беременности считают день обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке. В опытах используют виргинных самок линейных, гибридных или рандомбредных животных.
2.9.2. Тестируемое вещество вводят самкам один раз в сутки, желательно в одно и то же время. При отсутствии указаний о выраженной индукции или ингиби-ровании ферментов возможно введение лекарственных веществ с 1 по 19 день беременности в 2х-3х дозах.(п.1.6) Возможна и следующая схема введения препарата: с 1 по 6 (доимплантационный период), с 6 по 16 (органогенез), и с 16 по 19 дни беременности (фетогенез). В этом случае изучаемое вещество вводят с 6 по 15 дни беременности в 2х-3х дозах, в остальные сроки можно ограничиться введением одной высшей дозы (при отсутствии эффекта). Если по техническим причинам невозможно ввести вещество в течение указанных сроков (например, при внутривенном введении), экспериментатор может воспользоваться схемой введения, предусматривающей 3-х или 4-х дневное непрерывное введение вещества, учитывая при этом условия, изложенные в п. 2.5.
Крысам контрольной группы в эти же сроки следует вводить растворители, используемые при приготовлении раствора или суспензии тестируемого вещества. Кроме того,- может быть образована группа интактных беременных самок.
В ряде случаев, по усмотрению исследователя, целесообразно использование сравнительного контроля, т.е. животных, которым вводят уже применяемый в клинической практике препарат, близкий к изучаемому по химической структуре или аналогичный по профилю фармакологического действия. Для оценки реактивности экспериментальных животных можно использовать позитивный контроль при введении животным какого-либо эталонного тератогена (салици-ловокислый натрий, циклофосфамид и др.) в дозе, оказывающей эффект примерно у 50% зародышей.
2.9.3. Во время эксперимента следует наблюдать за состоянием и поведением беременных самок, регулярно, не реже одного раза в неделю, взвешивать животных для выявления возможного токсического действия изучаемого вещества.
2.9.4. Результаты оцениваются после эвтаназии и вскрытия самок. Вскрытие проводят на 20-й день беременности. ‘
2.9.6. При статистической обработке за единицу наблюдения принимают помет, т.е. результаты, полученные при вскрытии одной самки. Сведения о методах статистического анализа, использованных при обработке результатов, должны быть указаны в отчете.
2.9.7. ТЕСТИРОВАНИЕ НА КРОЛИКАХ Исследования проводят на виргинных самках. Каждая группа (в опыте и контроле) должна состоять не менее, чем из 12 беременных крольчих.
2.9.8. Изучаемое вещество рекомендуется вводить с 6 по 18 дни беременности (период органогенеза), один раз в сутки, в высшей дозе (п.2.3.). Группы контрольных животных должны быть такими же, как указано в п.2.9.2. Вопрос о том, использовать субстанцию или лекарственную форму, решается так, как указано в п.1.4. Результаты оценивают после эвтаназии и вскрытия самок. Вскрытие проводят на 27-28 день беременности. Можно прибегать и к хирургическому извлечению плодов у живых крольчих.
2.9.9. Показателями эмбриотоксичности служат те же показатели, что и у крыс (п. 2.9.5). Статистическую обработку результатов проводят так же, как изложено в п.2.9.6.
Исследование эмбриотоксического действия (наименование препарата) на (наименование вида животных)
Нарушения развития, отмеченные при исследовании плодов (наименование вида животных), полученных от самок, которым вводили (наименование препарата)
Вид нарушения
Группа животных (экспозиция, доза препарата)
Количество плодов, имевших данное нарушение
абс
% к общему количеству обследованных по этой методике
3. ИЗУЧЕНИЕ АНТЕНАТАЛЬНОГО ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, РЕГИСТРИРУЕМОГО В ПОСТНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ. 3.1. Целью исследований, проводимых на этом этапе, является выявление нарушений эмбрионального развития, проявляющихся только в иостнатальном периоде жизни. 3.2. Исследование проводят на виргинных самках линейных, гибридных или рандомбредиых животных. Как в подопытной, так и в контрольной группах должно быть получено потомство не менее, чем от 10 самок. Изучаемое вещество вводят самкам 1 раз в сутки с б дня беременности и до родов (период органо- и фетогенеза) в дозе, близкой к максимальной (п. 1.6). Контрольная группа самок должна получать в эти же сроки растворитель, используемый при введении препарата. Во время введения препарата необходимо регистрировать состояние и поведение самок, динамику массы тела, продолжительность беременности, течение родов. За 3-4 дня до родов беременных самок следует рассадить по одной в клетку и обеспечить их подходящей подстилкой для устройства гнезда. В каждом помете оставляют по 6-8 новорожденных (желательно одинаковое количество самок самцов). На 25- 30 день после рождения крысят отсаживают от матерей. 3.3. Исследования следует начинать вскоре после рождения, но не раньше, чем через 24 часа и, по возможности, продолжать до 2-х месячного возраста. Оценка включает следующие типы исследований: общие наблюдения за физическим развитием потомства; изучение скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания самкой; изучение двигательного и эмоционального поведения и способности к координации движений у потомства после окончания вскармливания; изучение обучаемости и памяти: выработка условных рефлексов как с положительным, так и с отрицательным подкреплением и сохранение полученных навыков. В исследованиях 1-3 типа должны быть обследованы все животные. При формировании групп для исследований 4 типа от каждого помета можно взять в группу по 2 животных. Программа изучения постнатального развития определяется экспериментатором с учетом фармакологических и токсических свойств изучаемого лекарственного вещества. Примерный перечень тестов указан в Приложении. В некоторых случаях он может быть расширен для получения дополнительной информации ( изучение влияния на клеточный состав крови, проведение биохимических, патоморфологических исследований, спаривание с последующим изучением потомства F1,F2 генераций и др.). Необходимо иметь в виду, что введение некоторых веществ во время беременности может неблагоприятно влиять на поведение самок, приводя к нарушению лактации, угасанию материнских инстинктов и т.п. В связи с этим может возникать необходимость перекрестного вскармливания потомства. 3.4. Для некоторых фармакологических веществ, применяемых во время грудного вскармливания, желательно изучение их влияния на развитие потомства. Исследования проводят при введении вещества самкам с 1 дня после родов до окончания вскармливания (25 день). Состояние потомства оценивают, как и при изучении постнатального развития (п.3.3.). 3.5. При статистической обработке полученных результатов в качестве независимой переменной используют среднее значение соответствующего показателя для отдельного помета. В связи с этим, при формировании групп для отдельных серий испытаний желательно, чтобы соблюдалось равное представительство от каждого помета. При этом необходимо предусмотреть возможность раздельного анализа результатов для самок и самцов. В отчете должны быть представлены сведения об использовавшихся методиках статистического анализа. 4. СХЕМА ОТЧЕТА О РЕЗУЛЬТАТАХ ИЗУЧЕНИЯ ЭМБРИОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ВЛИЯНИЯ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ ФУНКЦИЮ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА. 4.1. Представляемый в Фармакологический Государственный комитет Минздрава России отчет должен включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у изучаемого препарата неблагоприятного действия на внутриутробное развитие и процессы репродукции. Форма некоторых таблиц представлена в Приложении. 4.2. При описании аномалий развития следует руководствоваться общепринятой терминологией. Если трудно описать какую-либо из аномалий развития, следует представить фотографию плода с этой аномалией. 4.3. В заключительной части отчета необходимо дать оценку результатам тестирования по следующим направлениям: — оценка результатов, полученных при изучении влияния препарата на генеративную функцию; — оценка результатов, полученных при обследовании потомства в конце антенатального периода развития; — оценка результатов, полученных при обследовании потомства в постнатальном периоде развития. 4.4. Общее заключение о наличии или отсутствии повреждающего действия лекарственного средства на репродуктивную функцию и внутриутробное развитие.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДИКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПРИ ИЗУЧЕНИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ТОКСИЧНОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ.
1.1. Эвтаназия подопытных животных и получение эмбрионального материала. Эвтаназию самок осуществляют дислокацией шейных позвонков. Вскрывают брюшную полость, вырезают матку, переносят в чашку Петри с физиологическим раствором. Вскрывают рогя матки, подсчитывают количество живых мертвых, резервированных плодов, обследуют слизистую матки, отмечая места имплантации. Вынимают плоды, освобождают их из оболочек. В яичниках подсчитывают количество желтых тел беременности.
1.2. Наружный осмотр, взвешивание плодов. Все живые плоды каждого помета обследуют под бинокулярным микроскопом типа МБС для обнаружения внешних видимых аномалий развития. После этого плоды навешивают, отмечают состояние каждого плода и описывают аномалии, указывают массу каждого плода и суммарную массу плодов помета. После наружного осмотра плодов, регистрации всех аномалий и взвешивания, плоды каждого помета делят на две группы. Одну группу плодов (около 1/3) фиксируют в жидкости Буэна и используют для изучения внутренних органов. Остальных плодов фиксируют в 96′ этаноле и используют для изучения состояния скелета.
1.3. Исследование внутренних органов плодов по ме- тодике Вильсона в модификации отдела эмбриологии НИИЭМ АМН СССР. Исследования проводят на плодах, которые фиксировали в жидкости Буэпа но менее 1 недели. Плод укрепляют на пробковом столике и, при помощи безопасной бритвы, разрезом параллельно нижней челюсти отделяют голову от туловища. Первый разрез головы проводят перпендикулярно нижней челюсти непосредственно за вибрисами.На этом срезе видно состояние нижней челюсти, переднего отдела твердого неба и носовой полости. Второй разрез проводится через середину глазных яблок и охватывает обонятельные луковицы. На третьем разрезе изучают состояние головного мозга: коры больших полушарий, боковых, третьего и четвертого желудочков. Срез проводят через большой поперечный диаметр черепа. Четвертый разрез проходит параллельно третьему. Исследуют мозжечок и продолговатый мозг. Пятый разрез идет через гортань, пищевод, спинной мозг, сосуды и слюнные железы. Шестым разрезом отсекается шея от туловища. Разрез проводят перед передними лапами. Видны пищевод, трахея, спинной мозг, крупные сосуды. Седьмой разрез проходит через органы грудной клетки непосредственно за передними конечностями. На разрезе впдны: сердце, легкие, бронхи, пищевод, спинной мозг. Восьмой разрез проводят по середине между седьмым разрезом и пупочным кольцом. Осматрпвают печень, а затем осторожно удаляют ее пинцетом и исследуют состояние диафрагмы. Девятый разрез проходит ниже пупочного кольца. Видны кишечник, поджелудочная железа. Осторожно удалив петли кишечника и печень, можно наблюдать органы таза: почки, мочеточники, мочевой пузырь, прямую кишку, внутренние половые органы. Необходимо обратить внимание на почки (возможность гидронефроза), матку с придатками и тести кулы.
1.4. Метод висцерального исследования органов плодов по Стейплсу. После внешнего осмотра живых плодов на наличие аномалий развития, определения массы и краниокаудального размера, производят декапитацию. Декапитированный плод фиксируют, глазными ножницами разрезают переднюю бргопшую стенку и грудь вдоль левого края грудины. Пинцетом удаляют вилочковую железу и исследуют топографию и состояние крупных сосудов, отходящих от сердца (правая и левая подключичные артерии, общая сонная артерия, нисходящая аорта и легочная артерия). Обращают внимание на их форму и размеры. Пинцетом фиксируют сердце за ушко правого предсердия, рассекают сердце ножницами двумя разрезами от верхушки к основанию (1-правее, 2-левес межжелудочковой перегородки) и исследуют состояние межжелудочковой перегородки и клапанов. Затем исследуют состояние легких (количество долей) и органов брюшной полости. После извлечения печени, определяют состояние диафрагмы, а удалив петли кишечника, осматривают надпочечники, почки, мочеточники и мочевой пузырь. Почки разрезают на уровне почечных лоханок и исследуют их. Определяют абсолютную и относительную массу вилочковой железы, сердца, почек. Устанавливают пол плода и изучают топографию половых органов.
1.5. Окрашивание скелета ализарином (методика Доусона, модифицированная в отделе эмбриологии НИИЭМ АМН СССР). Плоды фиксируют в S6J этаноле не менее 7 дней. Объем спирта должен превышать объем фиксируемых плодов в 10 раз. После фиксации у плодов удаляют внутренности и погружают в 1% раствор КОН для просветления мягких тканей. Время пребывания плодов в этом растворе определяют эмпирически (примерно 1-2 суток). Когда становятся видны закладки костей, плоды вынимают, промывают водопроводной водой и перенося их в раствор А (150 мл глицерина, 300 мл дистиллированной воды и 10 г КОН), к которому добавляют несколько капель раствора Б (1% раствор ализарина красного) до появления светло-фиолетового окрашивания. Через 3-5 суток окостеневшие участки скелета окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Для обесцвечивания мягких тканей плоды переносят в раствор А на 7-14 дней, затем их проводят через смеси глицерина спирта и воды с целью обезвоживания (1:2:7,2:2:6,4:4:2, равные части спирта и глицерина, чистый глицерин с добавлением 1-2 капель формалина). В чистом глицерине плоды могут храниться. Плоды изучают под микроскопом МБС, учитывают аномалии скелета, количество точек окостенения в различных костных образованиях. 1.6. Методы изучения развития потомства в постнатальном периоде жизни.
Общие наблюдения за физическим развитием потомства
Изучение скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания
Изучение обучаемости и памяти
Способ проведения эксперимента
1
2
Пасивное избегание с отрицательным (болевым) подкреплением
Методика основана на естественной для крыс реакции, большей частью на стремлении переходить из освещенной камеры в темную. Крыс помещают в освещенную камеру размером 40x20x20 см. В 1 день обучения животные в темной камере получают электроболевое раздражение при силе тока 1 мА. Через 24, 48 часов исследуют время нахождения животных в освещённой камере (обычно не более 2-3 мин.).
Относительное число животных, не избегающих светлой камеры. Латентный период выхода в темную камеру при первом предъявлении. Латентный период выхода в темную камеру через 24, 48 часов после обучения.
Активное избегание с отрицательным (болевым) подкреплением
Проводится обычно в т.н. челночной камере, состоящей из двух отсеков, размером 20*20*20см и разделенных переходом или дверцей. В полу камеры решетки, на которые можно подавать ток силой 0,75-1,5мА (обычно определяют болевой порог ндивидуально для каждого животного и используют ток, равный 1,5 болевого порога). Обучение методом дискретных проб заключается в том, что каждое испытание начинается с сигнала (зуммер, свет). Если животное через фиксированное время (5-10 сек.) не переходит в безопасный отсек, подается электроболевое раздражение. Опыты проводят до достижения критерия обученности не менее чем у 80% животных контрольной группы. Критерием обученности является 18 успешных избеганий в серии из 20 опытов. Крыс обучают двухстороннему избеганию. При изучении долгосрочной памяти (например: 1, 7, 10 дней после достижения критерия) животным подвергают однотипным с обучением испытаниям. Угасание навыка исследуют каждый день, не подкрепляя сигнал болевым раздражением. Возможны модификации метода выработки этого рефлекса: одностороннее избегание, массированное обучение.
Среднее количество правильных ответов в зависимости от числа предъявлений.
Среднее значение болевого порога.
Среднее число межсигнальных реакций.
% ошибочных ответов при исследовании памяти.
Скорость угасания навыка.
Обучение в лабиринте с положительным (пищевым) подкреплением
Используют Т-, У-образные лабиринты, или многосекционные лабиринты. Животных взвешивают до начала ограничения в питании, после первого дня испытания и после достижения критерия обученности. Опыты продолжают до достижения критерия, подбираемого эмпирически при анализе кривой обученности. Опыты продолжают до достижения критерия не менее чем 80% животных контрольной группы. При отсутствии различий в скорости обучения, исследуют память обученных животных. При исследовании памяти необходимо, чтобы животные получили в процессе обучения сходное количество подкреплений.
Среднее количество правильных ответов в зависимости от числа предъявлений.
Частота (и длительность) различных актов поведения, в том и эмоциональная реакция на лабиринт.
Число различных элементарных актов поведения до достижения критерия обученности.
Потеря массы тела в процессе обучения и корреляция этого показателя со скоростью приобретения навыка.
1.8. Для морфологического изучения яичников их фиксируют в жидкости Карнуа, заключают в парафин, приготовляют срезы по типу топографических, через весь орган, толщиной 6 микрон, окрашивают гематоксилином и эозином. Эвтаназию животных проводят в стадии эструс или проэструс, что необходимо для последующего подсчета структурно-функциональных элементов в яичнике. Регистрируют: — примордиальные фолликулы и фолликулы с одним слоем гранулезных клеток; фолликулы с двумя и более слоями гранулезных клеток; — зрелые фолликулы (граафовы пузырьки); — атретические тела и атрезирующие фолликулы; — желтые тела; — общее количество генеративных форм. Указанные элементы подсчитывают по всей поверхности среза. Фолликулы примордиальные и с одним слоем гранулезных клеток учитывают в каждом 10 срезе и результат умножают на 10, фолликулы зрелые с двумя и более слоями гранулезных клеток, атретические тела подсчитывают в каждом 5 срезе, желтые тела фиксируют в срединном срезе. При количественной оценке микроструктуры яичника регистрируют только фолликулы, содержащие ядро и ядрышко.
Фундаментальные исследования