что такое фетальные клетки
ЭСК для «чайников»
Эмбриональные стволовые клетки
Эмбриональные стволовые клеткиЭмбриональные стволовые клетки и тканевые стволовые клетки – это разные вещи, и это надо хорошо понимать. Тканевые стволовые клетки находятся в очень большом количестве тканей нашего организма. Они отвечают за то, что у нас обновляется кожа, гематопоэтические стволовые клетки находятся в костном мозге, делают кровь. Недавно обнаружили нейрональные стволовые клетки.
Все эти клетки имеют некое общее свойство с эмбриональными стволовыми клетками – все они находятся на некоторой стадии недоразвития. Они недодифференцированы.
Эмбриональные клетки находятся в самом низу этой пирамиды, а тканевые стволовые клетки находятся уже повыше, поэтому их называют «мультипотентными», то есть они имеют потенциал к тому, чтобы превращаться в разные клетки организма обычно в пределах одной ткани. Поэтому их нельзя путать друг с другом. Остальные свойства этих клеток тоже довольно сильно отличаются.
Эмбриональные стволовые клетки получают из 5-дневного эмбриона человека. Другими словами это эмбрион, в котором, на самом деле, находится порядка нескольких сотен клеток. Это бластоциста – такой шарик, заполненный эмбриональными стволовыми клетками. Их можно выделять в культуру, они хорошо растут, они делятся практически бесконечно. В первый раз для человека их выделили более чем 14 лет назад и линии, которые тогда выделили, до сих пор культивируют лаборатории и они не меняют своих свойств. Получается, что мы умеем искусственно поддерживать эти эмбриональные клетки в «подвешенном» состоянии, в состоянии, в котором они находятся в эмбрионе.
У них, в отличие от тканевых стволовых клеток, помимо бессмертности и самовозобновления есть прекрасное свойство – это те клетки, из которых строится весь организм. То есть они могут дифференцироваться в любую взрослую клетку организма. Это свойство называется плюрипотентностью. Это очень важное свойство. Есть тесты на плюрипотентность. Например, мы можем сделать из мышиных клеток собственно мышь, введя их в бластоцисту мыши. То есть можно сделать мышь, полностью созданную из клеток, которые культивируют в лаборатории. Понятно, что мы не можем сделать человека, поэтому единственный тест, аналогичный мышиному, когда мы вводим эти эмбриональные стволовые клетки человека подкожно иммунодефицитной мыши, то есть той, у которой нет иммунного ответа. Часто на месте ввода этих клеток получается тератома – доброкачественная опухоль, она состоит обычно из тканей, принадлежащих к трем зародышевым листкам. Это говорит о том, что in vivo, то есть вживую, а не только in vitro, эмбриональные стволовые клетки человека могут дифференцироваться во все разнообразие тканей. Возможно, именно с этим связаны все страхи по поводу того, что они похожи на раковые клетки, поскольку они могут бесконечно делиться и образовывать тератомы в иммунодефицитных мышах. Но, на самом деле, раковые клетки бывают очень разные. И раковые клетки – это некие сломанные клетки, у которых сломан механизм самоподдержания и превращения во что бы то ни было. У эмбриональных же стволовых клеток, которые растут в культуре, ничего не сломано. Мы их поддерживаем в том состоянии, в котором они находятся в природе, то есть мы их можем контролировать.
Контролем судьбы клеток занимаются тысячи ученых, потому что эта область открывает прекрасные перспективы, когда мы можем взять эмбриональные стволовые клетки и искусственным путем сделать из них сердце, легкое, печень, все что угодно. Во-первых, это очень интересно, поскольку для биологов ЭСК это такое Lego, они могут проходить пути дифференцировки, и с их помощью можно проследить пути развития и пути превращения одной ткани в другую,. Во-вторых, если нам нужно протестировать, как лекарства влияют на эмбриональные клетки или на разные пути развития, мы можем делать это изначально в пробирке, что тоже очень удобно. Плюс мы можем вносить в эти эмбриональные клетки какие-то мутации, например нокауты, то есть выключать какие-то гены, которые важны, например, в эмбриональном развитии, и смотреть что будет. Если мы говорим про эмбриональные стволовые клетки мыши, мы даже можем наблюдать фенотип, то есть то, как проявляется включение тех или иных генов на разных стадиях развития.
Эмбриональные стволовые клетки берут из эмбрионов, которые остались после процедуры ЭКО. Обычно их делают небольшое количество, часть из которого подсаживают, часть нет. Ту часть, которые не подсаживают, с позволения пациентов, родителей, отдают на нужды лаборатории. И в этом нет никакого, на мой взгляд, живодерства, потому что это пятидневные зародыши, это бластоцисты, несколько сотен клеток, в которых нет разделения ни на нервную систему, ни какую бы то ни было. И как мы знаем уже из практики, это неспециализированные клетки, из которых может получиться все, что угодно. Однако может не получиться, поскольку никто не знает, разовьется этот конкретный эмбрион или нет.
Сейчас эмбриональные стволовые клетки в практике, в биомедицине кроме каких-то фундаментальных вещей используются как универсальный поставщик разнообразных тканей. И, учитывая, что мы можем делать более дифференцированные производные и научились их делать в довольно большом количестве, то можно пытаться делать какую-то заместительную тканевую терапию. То есть выращивать некую ткань, которая будет приживаться на месте поврежденной. Сейчас есть несколько клинических испытаний (проводятся на производных эмбриональных стволовых клеток), и одни из самых многообещающих тестов – это тесты на олигодендроцитах, которые получены из эмбриональных стволовых клеток. Эти олигодендроциты, это эмбриональные стволовые клетки, которые запущены в сторону нейронального развития, но это не конечная ветвь. Они еще могут развиваться дальше. Идея теста заключается в том, что когда происходит некая травма нервной системы, когда нейроны восстанавливаются, они не могут восстанавливать миелиновую оболочку вокруг них, а без нее сигналы не проходят. И олигодендроциты – это те клетки, которые создают миелиновые оболочки. Сейчас клинические тесты проводятся всего на 10-20 пациентах, потому, что главный вопрос в этих тестах сейчас состоит в том безопасны или нет эти клетки. Сегодня все еще есть страхи насчет того, что они, попадая в живой организм, будут вести себя непредсказуемо. Сейчас уже сделаны успешные тесты на крысах и на обезьянах. И пациенты, на которых делаются эти тесты, это пациенты довольно строгой группы, у которых были травмы позвоночника, в течение недели до того как эти клетки им подсаживают. Предполагается, что на таких ранних стадиях травматического восстановления как раз эти олигодендроциты помогают пациенту восстановиться и восстановить связи в его спинном мозге. На крысах и на обезьянах это получается.
Еще одна ветвь, по которой идут клинические испытания, это получение клеток пигментного эпителия из эмбриональных стволовых клеток. Пигментный эпителий – это сетчатка глаза и с ней связано очень много болезней как генетических, так и просто старческих. Например, дистрофия сетчатки – истончение сетчатки, когда люди постепенно перестают видеть. Сегодня мы довольно эффективно умеем делать из эмбриональных стволовых клеток клетки пигментного эпителия. Ученые пытаются подсаживать эти клетки пигментного эпителия больным дистрофией сетчатки. Глаз – очень удобная модель для контроля приживаемости трансплантата.
Предварительные тесты показывают, что все идет хорошо, и пациенты буквально прозревают. Но это предварительные исследования. И пока такая практика не ушла не то, что в клинику, но и ни в какие более серьезные группы пациентов. Поэтому пока еще рано говорить о всеобщем клиническом применении этих клеток. Но, тем не менее, уже понятно, что это можно делать. Так и до эры клинического применения стволовых клеток еще очень далеко. Все опыты с производными эмбриональных стволовых клеток затрудняются тем, что все-таки это клетка другого человека. Иммунологически они бывают, так же как и органы трансплантации, несовместимы с пациентом. В этом заключается самая большая проблема трансплантации с использованием производных эмбриональных стволовых клеток.
Автор – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории генетических основ клеточных технологий Института общей генетики РАН.
Фетальная генная терапия: от теории — к практике
Фетальная генная терапия: от теории — к практике
Фетальная терапия плода уже совсем скоро может позволить успешно лечить генетические аномалии, рак и другие заболевания
Автор
Редактор
Статья на конкурс «био/мол/текст»: «Миша родился 12 февраля здоровым ребенком. Но в 1,5 месяца я стала замечать, что на всех фотографиях малыш занимает одну и ту же позу, как будто его ножки неподвижны. Уже через несколько недель нам поставили диагноз, посочувствовали и посоветовали начать планировать второго, здорового ребенка». Из-за роковой комбинации генов Миша, как и остальные дети с этим заболеванием, был вынужден всю свою короткую жизнь бороться за каждое движение. Бороться отчаянно, изо всех сил, но в конце концов проиграть. Спинальная мышечная атрофия (СМА) относится к числу генетических аномалий, перед которыми человечество пока бессильно. Однако успехи генной терапии, за которыми сегодня наблюдает медицинский мир, могут перевести и СМА, и другие тяжелые наследственные патологии в разряд излечимых. Более того — излечимых еще внутриутробно.
Конкурс «био/мол/текст»-2018
Эта работа опубликована в номинации «Биофармацевтика» конкурса «био/мол/текст»-2018.
Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.
Природа ошибается, человек исправляет
«Биомолекула» уже писала подробно о том, какие возможности открывает генная терапия в лечении рака [2] и наследственных аномалий, в частности, пигментного ретинита [3].
Рисунок 1. Перенос генетического материала в клетку с помощью вирусного вектора
И если в 80-х годах прошлого века, когда о генной терапии заговорили довольно громко, ее теория многим казалась продолжением сценария ленты «Назад в будущее», то сегодня она стала реальностью, открывающей новые, поистине безбрежные перспективы.
Тем не менее очевидно, что генная терапия имеет ряд ограничений, особенно когда речь идет о наследственных заболеваниях. Прежде всего, патологический процесс в таких случаях может начаться еще внутриутробно. К моменту, когда заболевание, наконец, диагностируют, — а это порой происходит спустя годы после рождения ребенка, — могут развиться необратимые повреждения клеток и органов, что значительно сужает терапевтические возможности или вообще сводит их на нет [4].
Шанс решить эту проблему появился благодаря современной пренатальной диагностике, которая позволяет обнаружить хромосомные дефекты уже на ранних стадиях беременности. Получив любой фетальный материал с помощью инвазивных методик, можно быстро и достоверно диагностировать генетические заболевания. А в случаях с гемоглобинопатиями необходимость в инвазивных манипуляциях и вовсе отпадает: чтобы их выявить, достаточно исследовать фетальные ДНК, полученные из клеток крови матери [5].
Современные пренатальные диагностические методики в комбинации с достижениями генной терапии предоставляют уникальную возможность исправить «ошибку» природы и вмешаться в патологический процесс еще до необратимого повреждения клеток. Обеспечить лечение различных заболеваний ребенка в утробе матери или, по крайней мере, сдержать прогрессирование болезни, по всей вероятности, может фетальная генная терапия, или генная терапия плода.
Идея фетальной генной терапии далеко не нова: всего через несколько лет после первой попытки проведения генной терапии у взрослых, в 1994 году исследователи начали всерьез обсуждать применение инновационной методики внутриутробно [6]. Сегодня, когда лечение генетических заболеваний в утробе матери уже практически превратилось из фантастической перспективы в реальность, опубликована масса работ, где подробно изучена фетальная генная терапия и ее преимущества по сравнению с генной терапией взрослых.
Пренатально vs постнатально
Предваряя вопросы о целесообразности внутриутробной коррекции генетической аномалии, сразу же остановимся на преимуществах генной терапии плода по сравнению с постнатальной генной терапией.
Широкие возможности воздействия на органы и системы
Известно, что при многих генетических заболеваниях (к примеру, буллезном эпидермолизе или кистозном фиброзе) бывает довольно сложно повлиять на основные звенья патологического процесса практически сразу после рождения. Коррекция же мутантных генов у развивающегося плода позволяет быстро увеличить популяцию стволовых клеток, обеспечив большой пул трансфицированных клеток и, как следствие, выраженный терапевтический эффект.
Упрощенное производство клинического вектора, переносящего генетический материал
Дозировка вирусного вектора, с помощью которого переносят генетический материал, зависит от массы тела. Благодаря малому размеру плода удается достигнуть гораздо более высокого биораспределения вектора при той же его дозировке, что в ходе генной терапии взрослого. Это позволяет сэкономить и время, и средства. Представить, насколько существенна экономия, помогают простые сравнительные данные: так, плод в 14–16 недель беременности (оптимальный срок индуцирования вектора) весит около 100 г, в то время как средняя масса тела взрослого составляет около 60 кг.
Повышение эффективности терапии за счет неполноценного иммунного ответа
Рисунок 2. Трехмерная модель капсида аденоассоциированного вируса, содержащего 60 белковых субъединиц
Ряд исследований продемонстрировал, что гуморальный иммунитет к аденовирусам и аденоассоциированным вирусам (AAV) (рис. 2) определенных серотипов, которые обычно используются в качестве векторов, может приводить к неудаче при экспрессии трансгена [7]. Это может стать одним из критических барьеров для успешной трансплантации.
В группу риска попадают около 50% взрослых, имеющих приобретенный иммунный ответ к этим вирусным векторам [8]. Но даже при отсутствии чувствительности введение вектора у взрослых нередко приводит к развитию иммунного ответа, снижающего длительность и уровень трансгенной экспрессии. Так, после внутримышечной инъекции аденовирусного вектора с геном белка дистрофина взрослым мышам с миодистрофией Дюшенна образуются антитела к дистрофину [9], что сопряжено со значительным снижением эффективности экспрессии. В то же время плод в утробе матери иммунологически незрел, что позволяет доставлять вирусный вектор и трансгенный продукт без ограничения, которое накладывает иммунный ответ [10].
Очевидные преимущества фетальной терапии по сравнению с постнатальной коррекцией обеспечивают ее более высокую эффективность и целесообразность, особенно при тяжелых, опасных для жизни заболеваниях. Даже в случаях, когда полного излечения достигнуть невозможно, фетальная генная терапия может влиять на патологические звенья заболевания, облегчая его течение и улучшая прогноз. А, следовательно, именно она может стать единственной терапевтической альтернативой прекращению беременности для тысяч семей. Тем более что число заболеваний, которые потенциально могут оказаться под контролем при внедрении генной терапии плода в клиническую практику, поистине огромно.
Перспективы и возможности
Генная терапия плода, предположительно, способна взять под контроль множество опасных патологий. Лишь малая их толика представлена в таблице 1.
| Заболевание | Геннотерапевтический препарат | Целевые клетки и/или орган | Возраст манифестации заболевания | Распространенность | Продолжительность жизни |
|---|---|---|---|---|---|
| Кистозный фиброз | CFTR (трансмембранный регулятор) | Эпителиальные клетки дыхательных путей и кишечника | Третий триместр беременности | 1:4000 | Около 35 лет |
| Мышечная дистрофия Дюшенна | Дистрофин | Миоциты | 2 года | 1:4500 | 25 лет |
| Спинальная мышечная атрофия | Белок SMN | Мотонейроны | 6 месяцев (тип I) | 1:10 000 | 2 года |
| Гемофилия [12] | Фактор свертывания крови VIII или IX | Гепатоциты | 1 год | 1:6000 | При корректной терапии нормальная продолжительность жизни |
| Бета-талассемия | Глобин | Прекурсоры эритроцитов | До года | 1:2700 | До 20 лет |
| Болезнь Гоше | Глюкоцереброзидаза | Гепатоциты | 9,5 лет | 1:59 000 | Менее 2 лет |
| Дефекты цикла мочевины | Орнитина транскарбамилаза | Гепатоциты | 2 дня | 1:30 000 | 2 дня |
| Буллезный эпидермолиз | Коллаген тип VII | Кератиноциты | Рождение | 1:40 000 | При корректной терапии нормальная продолжительность жизни |
| Гипоксическая ишемическая энцефалопатия | Нейротрофические факторы | Кортикальные нейроны | Рождение | 1:1000 | При корректной терапии нормальная продолжительность жизни |
| Тяжелая внутриматочная задержка роста | Плацентарные факторы роста | Трофобласт | Плод | 1:500 | Несколько дней |
Кроме того, к числу патологий, которые, предположительно, могут поддаваться контролю с помощью фетальной терапии, относятся [5]:
Список заболеваний, которые могут оказаться «по плечу» фетальной генной терапии, поражает воображение: предположительно, эта методика позволит вмешаться в ранее неподвластные человеку патологические процессы, обусловленные моногенными заболеваниями. Их количество, по данным Всемирной организации здравоохранения, достигает десяти тысяч [10]. Тем не менее важно учитывать существование ряда ограничений, и в первую очередь рисков для матери и плода, сопряженных с проведением внутриутробной генной терапии.
Страхи и риски
Специфические риски пренатального переноса генов кардинально отличаются от рисков постнатальной генной терапии. Они включают краткосрочные неблагоприятные реакции и долгосрочные постнатальные эффекты. Их актуальность обостряется в связи с тем, что гипотетически экспрессия генов плода может оказывать непредсказуемое действие как на пренатальное, так и на постнатальное развитие [13].
Прежде всего, непосредственно сама процедура переноса связана с увеличением вероятности выкидыша, хориоамнионита и преждевременных родов. В исследованиях зафиксированы воспалительные реакции на вектор, в частности, инфильтрация печени и некроз печени при фетальной генной терапии овец [4].
Успех фетальной генной терапии может быть нейтрализован иммунным ответом плода, и это несет определенные риски для конечного результата. Гуморальный и клеточный ответы на введение вектора или трансгенного белка при посредстве трансдукторных систем клеток может элиминировать продукты переноса или нивелировать трансгенную экспрессию. При этом в исследованиях продемонстрирована зависимость силы иммунного ответа от срока гестации. Значительные иммунные реакции на введение лентивирусного вектора на ранних и средних сроках беременности зарегистрированы не были, тогда как при введении аденовирусного вектора на поздних сроках наблюдался мощный гуморальный ответ против капсидного антигена [4].
Одна из чрезвычайно важных проблем фетальной генной терапии заключается в потенциальном риске, который возникает при передаче плоду донорских последовательностей ДНК. Поскольку векторная интеграция в зародышевые клетки, по всей вероятности, будет носить случайный характер, она теоретически может иметь катастрофические последствия для плода. По сути, ребенок, получивший внутриутробно донорский генетический материал, рождается мутантом. Этическая составляющая генной терапии тревожит умы ученых и богословов. Последние еще со времен рождения самой известной в истории науки овечки предупреждают об опасностях, которые несет человечеству вмешательство в замысел божий.
Еще один важный аспект обусловлен вероятностью мутагенеза в клетках плода, приводящего к дефекту какого-либо функционального гена, что в конечном счете может стать причиной теперь уже нового, приобретенного генетического заболевания или злокачественной опухоли. Ее вероятность выглядит еще более реальной с учетом данных исследования на мышах, в ходе которого экспрессия генов у зародышей мышей дала толчок развитию опухоли печени [14].
В этом контексте могут оказаться далеко не случайными результаты двух исследований, продемонстрировавших развитие серьезных побочных эффектов после успешной генной терапии Х-сцепленного комбинированного иммунодефицита: в первом случае была зафиксирована манифестация моноклонального лимфопролиферативного заболевания, а во втором — альфа/бета Т-клеточной пролиферации. И в первом, и во втором случаях ретровирусный вектор интегрировался в непосредственной близости от гена LMO2 в пролиферирующих Т-клетках [15].
Теоретически генная терапия ex vivo может быть более безопасной по сравнению с in vivo фетальным введением вектора. Хотя это и не исключает вероятность мутагенеза в клетках, которые ретровирально трансдуцируются in vitro, введение мутагена можно легче определять и контролировать. Тем не менее полностью исключить эти осложнения, увы, нельзя.
И, наконец, фетальная генная терапия повышает восприимчивость клеток зародыша к трансдукции. Низкоуровневая ретровирусная трансдукция в предшественники зародышевых клеток наблюдалась в мужских и женских гонадах после внутрибрюшинного введения вектора эмбрионам овец и обезьян соответственно [13]. Анализ факторов, приводящих к непреднамеренной трансдукции, показал, что восприимчивость зародышевой ткани к ней зависит от гестационного возраста с более высокими показателями трансдукции на ранней стадии беременности [10].
С точки зрения потенциальных рисков очевидно, что фетальная генная терапия может быть обоснованным методом лечения только тяжелых генетических заболеваний, других вариантов коррекции которых не существует. И среди них, безусловно, болезнь Гоше, возможность внутриутробной генной терапии которой продемонстрировали в исследовании, опубликованном совсем недавно.
Первый пошел: болезнь Гоше
Рисунок 3. Структура димера глюкозоцереброзидазы — фермента, уровень которого патологически снижается при болезни Гоше
В июле 2018 года журнал Nature Medicine опубликовал результаты исследования на мышах, проведенного под руководством Симона Уоддингтона (Simon Waddington) из лондонского Института женского здоровья. Результаты работы продемонстрировали эффективность фетальной генной терапии в лечении нейродегенеративных заболеваний и, в частности, болезни Гоше [16]. Это самая частая форма среди редких наследственных ферментопатий, в основе которой лежит дефицит активности лизосомного фермента глюкозоцереброзидазы (рис. 3), обусловленный мутациями в гене глюкозилцерамидазы. В зависимости от характера мутаций, может развиваться тяжелая нейропатическая форма заболевания, манифестирующая с младенчества, или форма с более постепенным началом и менее выраженными симптомами. В то время как более легкие формы болезни Гоше хорошо поддаются заместительной терапии, тяжелая форма пока остается летальной. Признаки неизлечимой формы болезни Гоше появляются в первые месяцы жизни и включают прогрессирующую мышечную гипотонию, задержку и регресс психомоторного развития и другие неврологические признаки.
В ходе исследования Уоддингтон с соавторами продемонстрировал, что интракраниальное введение аденоассоциированного вирусного вектора 9 (AAV9) эмбриону мышей на 16 день гестации приводило к повышению экспрессии глюкозоцереброзидазы, что останавливало нейродегенерацию. При этом активность фермента в головном мозге была сравнима с таковой у здоровых мышей. Несмотря на то, что у больных грызунов все же диагностировался воспалительный процесс в головном мозге, они развивались достоверно лучше, чем мыши из группы контроля, которых пришлось усыпить через две недели после лечения из-за тяжести заболевания.
Мыши, подвергшиеся фетальной генной терапии, жили, по крайней мере, 18 недель, были фертильными и мобильными. Интересно, что введение вектора постнатально также облегчало течение заболевания, однако было менее эффективным, чем пренатальная экспрессия.
Поскольку AAV9 был способен проникать в мозг из кровотока, команда Уоддингтона провела еще один эксперимент, в ходе которого ввели значительно более высокую дозу вектора не в головной мозг, а непосредственно в кровь зародышей мышей. Мыши после экспрессии были в основном неотличимы от здоровых особей, но, поскольку по условиям эксперимента продолжительность их жизни составила только 55 дней, ученые не смогли сделать выводы о долгосрочной эффективности внутривенной генной терапии.
Эксперимент Уоддингтона стал самой сложной на сегодня работой, в ходе которой была проведена фетальная генная терапия у животных. Сегодня команда работает с корпорацией Apollo Therapeutics, объединившей усилия трех британских университетов и трех крупнейших фармацевтических компаний. Уоддингтон с коллегами преследуют новую цель: на сей раз перед ними стоит задача получить доклинические данные и потенциально протестировать лечение людей. И пока скептики размышляют над кругом возможностей применения фетальной генной терапии у человека, который может значительно сужаться из-за того, что болезнь Гоше не входит в пренатальные тесты, команда Уоддингтона уверенной поступью шагает в будущее. Будущее, где смогут выздоравливать дети с болезнью Гоше, миодистрофией Дюшенна, СМА и многими другими редкими, но сегодня, увы, неизлечимыми заболеваниями.